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背景子宫内膜异位症是一种具有恶性肿瘤行为的良性疾病,可以引起盆腔疼痛、月经异常及不孕等症状。育龄期妇女中患病率约为25%,其中30%～50%合并不孕。一直以来,子宫内膜异位症及其不孕的治疗效果均不十分理想,这与其发病机制及不孕机制不甚明确有关。近三十年来,科研工作者及临床医生对子宫内膜异位症做了大量的研究,尚未能完全阐明其相关机制。辅助生殖技术的广泛开展,不但为子宫内膜异位症合并不孕患者提供了良好的治疗方法,同时也为从不同角度及环节研究子宫内膜异位症导致不孕的机制提供了可能。多数学者认为子宫内膜异位症合并不孕患者与输卵管因素不孕患者相比,其体外受精-胚胎移植的成功率较低,这与子宫内膜异位症对精卵受精能力、胚胎质量及种植环境的影响均有一定关系。为使体外受精-胚胎移植成功率进一步提高,从各个层面探讨子宫内膜异位症造成不孕的机制尤为重要。目的观察子宫内膜异位症患者卵泡液对小鼠成熟卵子体外受精及未成熟卵子体外成熟与受精的影响,探讨子宫内膜异位症造成不孕的机制;检测子宫内膜异位症患者卵泡液ENA-78水平,了解子宫内膜异位症患者卵泡液微环境变化。方法一、子宫内膜异位症患者卵泡液对小鼠成熟卵母细胞体外受精的影响1、昆明白雌性小鼠经HMG促排卵,44～48小时后注射HCG,15～17小时脱颈法处死小鼠,取出输卵管,解剖显微镜下收集输卵管内成熟卵母细胞。将收集到的卵母细胞随机分为三组进行体外受精:空白对照组:DMEM液+10%胎牛血清+50IU/ml青霉素+50μg/ml链霉素;研究组:DMEM液+10%胎牛血清+50IU/ml青霉素+50μg/ml链霉素+40%子宫内膜异位症患者卵泡液;对照组:DMEM液+10%胎牛血清+50IU/ml青霉素+50μg/ml链霉素+40%输卵管因素不孕患者卵泡液。2、统计三组卵母细胞受精率。二、子宫内膜异位症患者卵泡液对小鼠未成熟卵子体外成熟及受精的影响1、昆明白雌性小鼠经HMG促排卵,44～48小时后脱颈法处死小鼠,取出卵巢,解剖显微镜下收集未成熟的卵母细胞。将收集到的卵母细胞随机分为三组进行体外成熟培养:空白对照组:DMEM液+10%胎牛血清+1IU/mlFSH+0.5IU/mlLH+0.5IU/mlHCG+50IU/ml青霉素+50μg/ml链霉素;研究组:DMEM液+10%胎牛血清+1IU/mlFSH +0.5IU/mlLH+ 0.5IU/ml HCG+50IU/ml青霉素+50μg/ml链霉素+40%子宫内膜异位症患者卵泡液;对照组:DMEM液+10%胎牛血清+1IU/mlFSH +0.5IU/mlLH+ 0.5IU/mlHCG+ 50IU/ml青霉素+50μg/ml链霉素+40%输卵管因素患者卵泡液。取卵当天及培养后24h、36h、48h、54h在倒置显微镜下观察三组卵母细胞的分期及成熟情况。排出第一极体(the first polar body,PBI)的卵母细胞判为MⅡ期(核成熟)。2、对三组体外成熟的MⅡ期卵母细胞进行体外受精。精子来源为昆明白雄性小鼠,体外受精液:DMEM液+10%胎牛血清+50IU/ML青霉素+50μg/ml链霉素。3、统计三组卵母细胞体外成熟率及体外受精率。三、子宫内膜异位症患者卵泡液中上皮中性粒细胞活化肽-78(epithelial neutrophil-activating peptide-78,ENA-78)水平的变化1、腹腔镜、开腹手术或卵巢囊肿穿刺证实为子宫内膜异位症患者及腹腔镜或开腹手术确诊为输卵管性不孕患者,采用黄体期降调节长方案进行促排卵,取卵时收集第一管无血液污染卵泡液,卵泡液经1000×g离心10分钟,取上清液,-20℃保存。2、ELSIA试剂盒对收集的卵泡液进行检测。结果一、子宫内膜异位症患者卵泡液对小鼠成熟卵母细胞体外受精的影响体内成熟小鼠卵母细胞在三种不同成份体外受精液中进行体外受精,研究组、对照组及空白对照组体外受精率分别为68.28%,74%,78.5%。三组体外受精情况比较,无显著性差异(P>0.05)。二、子宫内膜异位症患者卵泡液对小鼠未成熟卵母细胞体外成熟及受精的影响1、不同期别卵母细胞体外成熟情况: GV期小鼠卵母细胞研究组、对照组及空白对照组体外成熟率分别为25.81%,34.18%,38.38%,研究组成熟率明显低于对照组及空白对照组(P<0.05),对照组与空白对照组比较无明显差异(P>0.05);MⅠ期小鼠卵母细胞三组体外成熟率分别为46.33%,58.02%,62.83%,研究组成熟率明显低于对照组及空白对照组(P<0.05),对照组与空白对照组比较无明显差异(P>0.05);每组GV期与MⅠ期比较,MⅠ期体外成熟率均高于GV期,有显著性差异(P<0.05)。2、不同期别体外成熟卵母细胞体外受精情况来自GV期体外成熟的卵母细胞研究组、对照组及空白对照组体外受精率分别为41.67%,58.33%,58.77%,研究组受精率明显低于对照组及空白对照组(P<0.05),对照组与空白对照组比较无明显差异(P>0.05);来自MⅠ期体外成熟的卵母细胞三组体外受精率分别为57.43%,70.73%,73.33%,研究组受精率明显低于对照组及空白对照组(P<0.05),对照组与空白对照组比较无明显差异(P>0.05);每组GV期体外成熟的卵母细胞与MⅠ期体外成熟的卵母细胞比较,MⅠ期体外成熟的卵母细胞体外受精率均高于GV期,有显著性差异(P<0.05)。三、子宫内膜异位症患者卵泡液中ENA-78水平的变化研究组患者卵泡液中ENA-78浓度平均为185.55±71.75 pg/ml,对照组患者卵泡液浓度平均为130.79±55.13pg/ml,两组比较研究组患者卵泡液水平明显高于对照组,有显著性差异(P<0.05)。结论1.子宫内膜异位症患者卵泡液对小鼠体内成熟卵母细胞受精能力无明显影响;2.子宫内膜异位症患者卵泡液不仅降低了小鼠未成熟卵母细胞体外成熟能力,而且降低了体外成熟卵母细胞的受精能力。其机制主要是对卵母细胞的生长发育过程产生不良影响,使其受精能力下降;3.子宫内膜异位症患者卵泡液中ENA-78水平较输卵管因素不孕患者升高,其高水平的ENA-78可能是子宫内膜异位症患者卵母细胞质量下降、受精能力受损的原因之一。