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研究背景原发性肝癌,是起源于肝细胞或肝内胆管上皮细胞的恶性肿瘤,属于我国常见的恶性肿瘤之一。流行病学研究显示,肝癌在全球癌症发病率中位列第3,我国肝癌患病率位居世界第1,居我国癌症死因的第2位。目前肝癌的最佳治疗方式是手术切除,因此早期影像诊断对于肝癌尤为重要。肝癌的影像诊断方法主要包括磁共振成像(MRI)、计算机断层扫描(CT)、正电子发射断层扫描(PET)及超声检查(US)。而MRI具有无创检查、三维成像和高密度分辨率的优势,在肝癌诊断中备受关注。对比剂可增加MRI图像对比度,从而提高影像诊断率。对比剂可分为顺磁性对比剂和超顺磁性对比剂两种,以钆和锰为代表的顺磁性对比剂主要用于T1WI成像,临床以马根维显最为常用;以铁为代表的超顺磁性对比剂主要用于T2WI成像,以SPIO最为常见。多次应用钆基对比剂可导致肾纤维化,同时SPIO应用于T2WI使图像信号减低可能丢失图像信息,因此锰基对比剂引起了国内外学者的关注。虽然锰具有神经系统和循环系统毒性,但是经研究发现低剂量氧化锰不足以导致帕金森病和心脏毒性。另外,锰离子的核外不成对电子较多,T1加权效果强于钆离子。右旋糖苷是由葡萄糖组成的亲水多聚糖,具有良好的生物兼容性,作为大分子物质可以延长药物的循环时间,主要用于药物和蛋白质的转运。此外,右旋糖酐的代谢主要在细胞溶酶体中降解,少量经葡糖聚酶降解和小胆管排泄。研究表明,右旋糖酐分子量越大,其代谢越快。基于此,本研究制备了氧化锰-焦糖纳米球用于肝胆恶性肿瘤的MRI T1加权成像。其具备以下特征:1、焦糖纳米球作为运载体,可延长氧化锰的循环时间,从而实现长效延迟强化;2、焦糖纳米球可通过细胞内溶酶体降解,具备潜在的pH响应性,实现对比剂可降解肿瘤靶向特性;3、肿瘤EPR效应、长效循环和pH响应可躲避肝脾内网状内皮细胞的吞噬,实现肝胆恶性肿瘤MR T1加权成像。研究目的验证长效可降解的氧化锰-焦糖纳米球(Mn@CNS)应用于肝胆恶性肿瘤磁共振T1加权成像的可行性并探讨其肿瘤增强机制,以提高肝胆恶性肿瘤的特异性诊断。研究方法1.纳米球构建与表征:以葡萄糖单体为原料,通过水热合成法制备焦糖化纳米球,再通过氧化还原反应与高锰酸钾偶联,制备氧化锰-焦糖纳米球。用透射电镜(TEM)观察纳米球大小,用红外光谱分析纳米球表面功能基团;通过MR T1 Mapping和T2Tapping测试纳米球的弛豫率r1和r2,并且与Gd-DTPA(马根维显)的弛豫率比较。2.体外实验:通过细胞毒性实验CCK8测试Mn@CNS对人肝癌细胞系HepG2的活力影响;通过电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)测定小鼠巨噬细胞系RAW264.7、大鼠肝细胞系BRL-3A与人肝癌细胞系HepG2对Mn@CNS的摄取量;通过流式细胞仪测试右旋糖酐硫酸酯钠是否对异硫氰酸荧光素标记(FITC)的Mn@CNS存在竞争性抑制;通过Western Blot测定RAW264.7、BRL-3A、HepG2摄入Mn@CNS过程中清道夫受体(ScR)表达量的变化;通过TEM观察RAW264.7、BRL-3A、HepG2对Mn@CNS摄取途径;通过激光共聚焦显微镜观察Mn@CNS在RAW264.7、BRL-3A、HepG2三种细胞内细胞器定位。3.动物实验:通过亚硝基二乙胺(DEN)与硫代乙酰胺(TAA)分别诱导SD大鼠原位肝癌与肝内胆管癌,肝癌组经尾静脉注射Mn@CNS多时间点观察肿瘤强化效果,肝内胆管癌组进一步证实Mn@CNS强化效果的可重复性,肝内胆管癌组经尾静脉注射优维显(Gd-EOB-DTPA)与Mn@CNS对比延迟强化特点;处死大鼠,解剖肝脏,TEM观察不同时间点大鼠肝胆恶性肿瘤对Mn@CNS排泄途径;Western Blot测定Mn@CNS对Balb/c小鼠肝内锰代谢相关蛋白二价金属离子受体(DMT-1)和转铁蛋白受体(TfR)的影响;PAS染色观察大鼠肝癌对焦糖化右旋糖酐代谢变化。结果1.TEM结果显示CNS和Mn@CNS的直径分别为140nm和160nm,并且纳米粒表面有黑色物质被覆,表明氧化锰与焦糖化右旋糖酐已成功耦合。红外光谱显示Mn@CNS的峰值是3300cm-1,表明Mn@CNS表面含有羟基。T1 Mapping与T2 Mapping结果显示Mn@CNS的r1及r2分别为11.63和41.36 mM-1s-1,而马根维显的r1及r2分别为4.11和4.82 mM-1s-1。,表明Mn@CNS比马根维显有较高的弛豫率。2.细胞毒性CCK8实验显示HepG2与不同浓度(25,50,100,200 μg/mL)的Mn@CNS共培养12 h,24h,36 h,48h,细胞活力介于80%至120%之间,表明Mn@CNS没有明显细胞毒性。3.细胞摄取实验ICP-AES测得RAW264.7,BRL-3A和HepG2在摄入Mn@CNS前后的锰离子量分别为 18.69± 1.27,20.03±1.13,11.71 ±1.22 和 21.51 ±0.8,38.17 ± 1.93,63.67 ± 3.54 pg/细胞,表明锰离子摄取量HepG2>RAW264.7>BRL-3A。4.竞争性抑制实验结果显示从1倍至50倍增加右旋糖酐硫酸酯钠的量,RAW264.7对FITC-Mn@CNS摄入量明显降低,表明右旋糖酐硫酸酯钠对ScR存在竞争性抑制。5.ScR的Western Blot结果显示Mn@CNS可明显上调RAW264.7内ScR的表达(p<0.05),而BRL-3A和HepG2无明显上调作用,表明RAW264.7依赖ScR摄入纳米粒,而BRL-3A和HepG2可能通过其他方式摄入纳米粒。6.细胞TEM显示RAW264.7,BRL-3A和HepG2可在不同时间点经胞吞摄入Mn@CNS,形成囊泡(核内体),最终与溶酶体融合降解,表明三种细胞均可摄取纳米粒,最终经溶酶体降解。7.激光共聚焦显微镜显示FITC-Mn@CNS在RAW264.7,BRL-3A和HepG2内最终定位于溶酶体。8.大鼠MRI结果表明大鼠原位肝癌及肝内胆管癌可明显延迟强化达1d,强化高峰出现在注药后4h;注射优维显后大鼠肝内胆管癌仅延迟强化2h,肝胆期出现于45min。9.PAS染色显示注药后3h内肝癌内Mn@CNS较高,而1d后基本恢复至初始状态,表明Mn@CNS可经过溶酶体降解。10.肝癌和肝内胆管癌TEM显示Mn@CNS被摄入肝癌细胞内并且小胆管内未见Mn@CNS,表明Mn@CNS主要经溶酶体分解排泄。11.TfR及DMT-1的Western Blot结果显示Balb/c小鼠肝内DMT-1明显上调(p=0.002),而TfR未见明显上调,表明肝内锰的代谢转运主要依靠DMT-1。结论通过水热合成法成功构建了氧化锰-焦糖纳米球,具有T1弛豫率高、细胞毒性小、可降解及长效延迟的特点。纳米粒主要被肝癌细胞及巨噬细胞摄取,在溶酶体内降解排泄,并且纳米球可躲避巨噬细胞的摄取,积聚于肿瘤细胞。T1加权MRI显示肿瘤经氧化锰-焦糖纳米球注射后明显强化,延迟强化时间明显高于肝胆特异对比剂优维显。