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目的系膜增生性肾炎(mesangial proliferative glomerulonephritis,MsPGN )是我国多种肾小球疾病中最常见的病理类型之一,约占我国肾活检病人的50%左右,其主要的病理变化是系膜细胞(mesangial cell, MC)的增殖和系膜基质沉积。免疫炎症、遗传等多种因素可导致促进/抑制系膜增殖的平衡紊乱,随后出现的持续性系膜增殖和系膜基质积聚最终引起不可逆性的肾小球硬化。抑制系膜细胞过度增殖是系膜增生性肾炎的重要治疗措施。既往研究多集中于寻找促进系膜细胞增殖的基因,对其进行调控以达到延缓或防治疾病进展的目的,但其效果并不理想。因此我们以寻求抑制系膜增殖的因子为切入点,探讨这部分因子在系膜细胞增殖过程中所起作用。一般认为,MsPGN的进展(系膜细胞增殖)过程中,增殖期内促进系膜细胞增殖因子上调而相拮抗的抑制增殖因子下调。到恢复期时,促增殖因子下调而抑制因子上调。基于这一思路,本研究的目的在于寻找可能抑制抗Thy1系膜增生性肾炎大鼠模型中系膜细胞增殖的相关基因,并对其抑制系膜细胞增殖的功能进行体外验证。方法培养OX-7杂交瘤细胞株产生抗Thy1抗体,FPLC纯化后尾静脉注射Wistar大鼠制备抗Thy1系膜增生性肾炎大鼠模型,检测不同时间点(0、3、5、7、10、14天)的肾功能和24h尿蛋白,留取肾组织,分离肾小球并提取总RNA。利用大鼠U230 2.0芯片进行扫描,SAM、Gominer软件分析所得数据获得差异表达基因群及基因功能的分类,重点分析增殖期(5天和7天)内与增殖进程相关的基因群表达情况。荧光定量PCR(Taqman探针法)对部分增殖相关的差异表达基因(Ratio≥1.50或≤0.67,且Score≥2或≤-2,q-value<0.05,FDR<5%)进行验证,筛选可能抑制系膜细胞增殖的候选基因。同时培养大鼠系膜细胞(RMC),设计合成抑制KLF15表达的siRNA,利用RNAi技术敲低RMC中KLF-15(Kruppel-Like factor 15)的表达,并以无关siRNA为对照,。实验分组:1)无血清组;2)正常对照组;3)siCon转染组;4)siKLF转染组。24/48h后,MTT实验和流式细胞仪技术分析细胞增殖活性及细胞周期的改变情况,Western Blot及间接免疫荧光检测细胞周期蛋白CDK2、CyclinD1、p21的表达变化。结果1.纯化出的抗Thy1抗体效价高、纯度高、特异性好,并利用该抗体制备了抗Thy1系膜增生性肾炎大鼠模型:与对照组大鼠相比,模型组大鼠第5天和第7天肾小球系膜细胞增殖明显,而10天和14天逐渐降低。24h尿蛋白定量特点为第5天和10天显著升高(p<0.05, n=6),而第10天后开始下降;2.基因芯片共检测到9033个已知基因,其中至少在一个时间点与对照组相比有差异表达的有1001个基因,已知功能的基因为619个,主要功能为结合功能、催化功能、分子转导功能、转运功能、转录调节功能以及酶调节等功能。GOminer软件对其进一步分析表明,增殖期和恢复期中与细胞增殖进程相关的差异基因分别为19个(第5天)、21个(第7天)、21个(第10天)、21个(第14天)。这部分基因中,第5天和第7天中出现上调且可能具有抑制增殖功能的基因有KLF15、Mxi-1等,第5天和第7天出现上调且具有促进增殖功能的基因有TIMP-1、Ccl-2、S100A4等。荧光定量PCR对这部分基因进行验证,结果表明基因的表达变化趋势与基因芯片检测结果一致,皮尔森检验相关系数(>0.90,p<0.05, n=6);3.与正常组及siCon转染组相比,合成的siRNA可特异抑制筛选出的转录调控基因KLF-15的mRNA和蛋白表达水平p<0.05。MTT检测结果表明,siKLF组细胞数增多,经流式细胞仪分析证实,与siCon组相比,处于S期细胞明显增多,p<0.05, n=3。免疫印迹及间接免疫荧光检测结果表明,与siCon组及正常对照组相比,siKLF组细胞周期相关蛋白CDK2、cyclinD1及p21的表达均上调(p<0.05, n=3)。结论1.本研究利用纯化后的纯度高、特异性好、效价高的抗Thy1抗体,制备了抗Thy1大鼠模型;2.利用基因芯片和生物信息学技术分析获得抗系膜增生性肾炎模型的疾病进展过程中差异基因表达谱,并筛选出部分增殖相关基因;3.抑制KLF15的表达后,可出现系膜细胞的周期蛋白CDK2、CyclinD1和p21的表达水平发生改变,从而使S期系膜细胞增多,提示KLF15在系膜细胞增殖过程中扮演重要的角色,为调控系膜细胞增殖的研究提供了新的思路。