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前言 1981年Parkman发现CD43表达异常与X连锁的隐性遗传病——Wiskott-Ablrich综合征(WAS)密切相关，CD43开始引起人们的关注。1990年Ardman等在HIV-1感染的患者体内检测到抗CD43的自身抗体引起了人们对CD43的进一步兴趣。二十年间国外对CD43的研究一直饶有兴趣，但对CD43的精确功能目前仍知之甚少。 CD43(leukosialin)，又名涎福林(sialophorin)，是一种跨膜糖蛋白，存在于人、大鼠、小鼠中，广泛地分布于造血干细胞前体、胸腺B细胞前体、原始红细胞、T细胞、部分B细胞、单核细胞、血小板、中性粒细胞表面，其分子组成含有约40％的蛋白质和60％的糖类，主要由O-连接。采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测得不同细胞上CD43分子量介于95～150kDa之间，导致其分子量差异的主要原因可能是不同细胞CD43分子唾液酸化程度不同。人CD43分子为单链结构，带有一个N-糖基和多个O-糖基位点，可分为细胞内、跨膜区、细胞外三部分，细胞外部分由234个氨基酸组成，跨膜区由23个氨基酸组成，细胞内C端含有123个氨基酸残基。CD43具有多种生物学作用，包括参与细胞间粘附调节，介导淋巴细胞、单核细胞、粒细胞活化时的信号传递，也可以作为粘附分子与细胞间粘附分子-1(ICAM-1)发挥作用等。 目前国内关于CD43的基础研究还较少报道。国外的报道基本上以细胞激活剂肉豆蔻酰佛波醇乙酯(PMA)为活化剂，PMA是蛋白激酶C(PKC)的特异性激动剂，在短时间内(一般1小时以内)使细胞活化对其进行各种检测。本实验试图通过以PWM为活化剂，体外较长时间培养外周血单个核细胞汗BMCL检测其CD43的表达变化，为CD43分子的深人研究积累资料。 材料与方法 常规法分离外周血单个核细胞，培养细胞加人 PWM，使PWM的终浓度为 10pg／Inl，同时设置阴性对照孔，置 37T 5％CO。培养箱培养。分别将第0天、第二天、第3天和第5天的细胞离心沉淀提取膜蛋白。将细胞培养上清及膜蛋白经小层析柱除盐后冷冻，经真空冷冻干燥机冻干。将上述得到的细胞裂解物及培养上清冻干蛋白分别力人 100PI 双蒸水，SDS－PAGE电泳及 Western blot－ting观察免疫印迹带并照相。同时分别将第0天、第1天、第3天和第5天的细胞用抗CD43－FITC标记，使用 Cell quest多功能获取、分析软件，以抗lgGI－FITC作为阴性对照，进行FACS检测。 实验结果 （一）免疫印记分析（Western blot）结果 应用抗CD43单克隆抗体Dryl免疫印记分析（Weste。blot入在正常人PBMC的细胞膜裂解产物中检出一条分子量约为115KDa的 CD43分子，CD43分子的表达不受 PWM刺激的影响，实验组与对照组未见区别（如附图1所示八在所培养的时间内，无论有无PWM的刺激，在正常人PBMC的培养上清中均未检出可溶性的CD43分子。 （二）流式细胞仪检测结果 应用FITC标记的抗CD43单克隆抗体（与免疫印记分析的单抗相同，均为Dryl）进行流式细胞仪检测，结果如附图2所示。对其平均荧光强度（MFI）的统计见附表＼实验组与对照组组间 ·2·门是否加人＊＊M）P＞o．05，未见显著差异；实验组与对照组组内门不同培养时间乃＞O．05，亦未见显著差异。 讨 论 Carlsson等采用SDS－聚丙烯酚胺凝胶电泳法测得不同细胞上CD43分子量介于95刁 之间，导致其分子量差异的主要原因可能是不同细胞CD43分子唾液酸化程度不同。用蛋白酶作用于干或祖淋巴细胞，研究CD43分子结构与功能的关系，结果表明CD43分子上有许多功能不同的表位。近几年来已制备出多种针对人CD43不同表位的单克隆抗体。 人中性粒细胞在PMA等活化时，细胞表面CD43表达明显下降。本实验中使用流式细胞仪观察PWM的活化作用对PBMC表达CD43的影响，对其平均荧光强度（MFI）的统计分析结果显示，DFVfl克隆系的C侧抗体检出的 PBMC表达CD43不受PWM影响，分析原因门）可能由于刺激原的因素末使PBMC表达CD43发生改变；p）可能是由于使用的抗体识别表位的限制，未能识别其他表位的CD43分子。众所周知PBMC是个不均一的细胞群，使用淋巴细胞分层液分离的PBMC中，大部分为淋巴细胞，还含有单核细胞及血小板等，所以细胞胞膜表达 CD43分子量应介于一个范围之间。我们使用Western blot分析，以用来观察分子量。本实验在PBMC的胞膜裂解蛋白中检出一条CD43印记带，此印记带的分子量在115 KDa左右，与以往的报道基本相符。在本实验中只检出一条带，分析原因可能主要还是由于使用的抗体识别表位的限制，未能识别其他表位的CD43分子。 本实验椭IJ采用 DFTI和 Bra7G克隆系进行 Western blot，虽然这两个克隆系的特异性识别位点还未完全确定，但可以肯定的是它们不能完全棚u所有不同表位及分子量的CD43。DFTI克隆 ·3·系可与CD43的细胞外的表位反应，因此，它识别的分子量会介于一个范围一这可以解释所出现的印记?