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脊髓灰质炎病毒是一种严重危害儿童身体健康的小RNA病毒.随着全球脊髓灰质炎疫苗免疫计划的实施,由野生型病毒引起的脊髓灰质炎发病率急剧下降,而疫苗衍生的脊髓灰质炎病毒(VDPV)日益受到人们的重视.目前普遍使用的口服脊髓灰质炎减毒活疫苗(OPV)存在着因基因突变和基因重组而引发疫苗相关麻痹型脊髓灰质炎(VAPP)的危险.尤其是脊髓灰质炎病毒疫苗株(V)和其它非脊髓灰质炎肠道病毒(NPEVs)通过基因重组形成的嵌含病毒(V/NPEV)导致的麻痹病例近年来迅速增多,其进化过程表现出一种新的动向和趋势.2000-2001年中美洲海地和多米尼加共和国暴发了脊髓灰质炎.从病人体内分离出来的病毒都是重组体,其中5非翻译区和编码衣壳蛋白的核酶序列来源于Sabin疫苗株,而大部分非衣壳蛋白序列来自于其它肠道病毒,至少有4种不同的肠道病毒同当地流行的Ⅰ型脊髓灰质炎疫苗株发生了重组,这些重组的病毒因毒力恢复而造成了人群中脊髓灰质炎的发生.值得注意的是,在埃及和菲律宾也发生了两次类似的小规模暴发.因此,对这种新出现脊髓灰质炎病毒的基因重组方式进行深入细致的研究具有非常重要的理论和现实意义.本课题的设计思路是,将Ⅰ型脊髓灰质炎病毒(PV<,1>)完整的P<,2>区基因用来自柯萨奇病毒B<,3>型的相应基因代替,构建出嵌合体cDNA,期望通过对该嵌合体cDNA转染真核细胞后引起的细胞生物学特性方面的变化进行研究,获得有关重组基因表达、多蛋白剪切、病毒其因组复制、病毒颗粒装配等方面更多的认识,为研究病毒的重组现象提供必要的实验依据.我们首先构建了以pcDNA<,3>为载体,包含脊髓灰质炎病毒Ⅰ型5非翻泽区(5NTR)和衣壳蛋白(P<,1>区)基因,柯萨奇病毒B<,3>型(CVB<,3>)P<,2>区基因,脊髓灰质炎病毒Ⅰ型P3区和3非编码区(3NTR)基因的重组真核表达质粒pSCS.然后利用脂质体Lipofectamine-2000将这种质粒转染到人胚肺二倍体细胞(KMB-17)中,经培养后发现少数细胞胞体由细长变得粗短,细胞体积增大,形状变圆甚至从培养板上脱落,还有一部分细胞发生皱缩,聚集在一起呈葡萄状,细胞的生长速度明显减慢.而转染了空PcDNA<,3>质粒的细胞其形态和生长速度均未发生改变.电子显微镜下这些转染细胞的胞浆内溶酶体颗粒明显增多;许多线粒体肿胀,线粒体内膜嵴断裂、数目减少,有些线粒体内出现大的空泡;粗面内质网扩张.盲传的细胞也发生了和转染细胞相类似的变化.在这两种细胞内还观察到一些大小与脊髓灰质炎病毒相似,表面具有一定立体结构的小球形电子致密颗粒,由于它们大小很不均一、缺乏肠道病毒典型的晶格样排列方式,而且在免疫电镜中加入脊髓灰质炎病毒抗体后,并未在这些颗粒之间形成抗体桥而使它们聚集在一起,根据以上特点,我们将其定性为病毒样颗粒(VLP).RT-PCR实验证明pSCS质粒转染细胞后其嵌合病毒基因得到了转录.通过免疫沉淀实验,我们检测了pSCS质粒转染KMB-17细胞后不同标记时间病毒蛋白的表达情况,结果显示,PV<,1>感染的对照细胞在约38KD处出现一明显条带,<35>S-Met标记8h、16h、24h、36h的转染细胞在此出现了同样的条带,但这些条带很弱.我们初步判断此条带为VP<,0>蛋白,说明重组质粒中的P<,1>区基因得到了表达并发生了一定程度的剪切.通过蔗糖密度梯度离心和液闪仪计数实验,我们还对pSCS质粒转染KMB-17细胞后可能的病毒颗粒形成过程进行了分析,发现重组质粒转染细胞内标记蛋白的动态变化过程类似于脊髓灰质炎病毒(疫苗株)在正常细胞内的复制和装配过程,呈现出一种随标记时间延长,由5s颗粒发展为14s颗粒并最终形成160s成熟病毒粒子的演化趋势.从pSCS质粒转染的细胞中我们提取出蛋白,通过免疫小鼠制备出抗体并进行了中和实验,结果显示,这些抗体可以在一定程度上保护细胞免受脊髓灰质炎病毒的攻击,但它们对柯萨奇病毒B3型的感染却没有任何中和作用.以上研究为我们进一步探索脊髓灰质炎病毒的重组机制及重组病毒与细胞之间的相互作用提供了有价值的信息.