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近几年流行的全基因组关联研究(genome-wide association study,GWAS)是一种在全基因组范围内检测DNA序列变异与特定疾病或复杂表型之间关联的研究方法,它并不需要预先知道易感基因(predisposing genes)或致因突变(causative mutations)的物理位置,但可以检测出单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)与特定表型之间的关联。本研究以华南农业大学杏花鸡×隐性白羽洛克鸡全同胞资源群3代共554个个体样本为实验材料,采用Illumina公司的60K Infinium Ⅱ chicken SNP Beadchip芯片进行基因分型,对鸡肉质、屠体及生长性状进行GWAS研究,期望找到与肉质、屠体和生长性状密切相关的基因组区域、致因突变或基因。同时用芯片数据构建了鸡的高密度SNPs遗传连锁图谱,为精确定位数量性状座位(quantitative trait loci,QTLs)奠定基础,也为进一步解析各表型性状的分子遗传机理,为标记辅助选择等提供支持。
本实验首先对表型数据等进行正态性检验,以减少极值(Outlier)对结果的影响。结果表明17个肉质性状中只有胸肌肉色、腿肌电导率等5个性状在Box-Cox校正后仍然不服从正态分布;27个屠体性状中有11个性状在Box-Cox校正后仍然不服从正态分布;29个生长性状中只有35日龄体重、63日龄胫直径等4个性状在Box-Cox校正后仍然不服从正态分布。在全部的73个性状中,有72.6％的性状服从或近似服从正态分布,说明大部分性状数据可靠,可用于后续分析。
根据基因型结果对样品DNA质量进行检测,表明去除读出率(call rate)小于95％的样品后,还有488个F2个体可用于后续的关联分析。同时对SNPs的分型质量进行严格检查,有47,678个SNPs通过了各项标准,具有高质量的分型结果,可以用于后续的关联和连锁分析。
单标记关联分析表明,与各肉质性状相关联(经验P＜1×10-4)的SNPs共有75个。为了减少关联结果的假阳性率,本实验采用连锁不平衡(linkage disequilibrium,LD)修正的Bonferroni校正对P值进行校正。LD分析表明华南农业大学杏花鸡×隐性白羽洛克鸡全同胞资源群共有11,795个单倍型块和12,727个“独立”SNPs,独立检验数为24,522。因此,关联显著性水平设置的三个水平分别为:低显著性(suggestive significant)水平P＜4.08×10-5、显著性(significant)P水平＜2.04×10-6和高显著性(highly significant)水平P＜4.08×10-8。Bonferroni校正后仅有GGaluGA129401(P=1.71×10-7)、GGaluGA323816(P=8.77×10-13)和rS15693751(P=1.54×10-12)共3个SNPs分别与胸肌pH或腿肌纤维横截面积达到显著性关联,但在7号染色体上6601825-10416187共3.8 Mb的区域内有11个SNPs与腿肌电导率存呈低显著性关联,且LD分析表明这11个点处在4个紧密连锁的单倍型块内,该区域内包括S100钙结合蛋白B(S100 calcim binding protein B,S100B)基因等多个与脂肪细胞和肌细胞分化有关的基因,可能是肉质性状的QTLs候选区域。
关联分析表明与各屠体性状相关联(经验P＜1×10-4)的SNPs共有467个,Bonferroni校正后仍有52个位点与各屠体性状呈显著关联(P＜2.04×10-6)。其中位于葡萄糖调节蛋白94(glucose-regulated protein,GRP94)基因内含子7的GGaluGA019084位点同时与宰前活重、胸肉重、翅膀重以及胸宽存在显著关联,GRP94基因调节IGF-Ⅱ的分泌,对肌肉的生长发育非常重要,因而能够影响鸡的生长发育,该位点可能是对宰前活重等屠体性状有重要影响的位点。Rs13973515、GGaluGA055359和GGaluGA055379都与宰前活重、胸肉重、翅膀重、胫爪重等多个性状关联显著,经分析发现这3个SNPs都位于与肌肉发育密切相关的FOX01(forkhead box 01)基因附近,且LD分析发现,这3个位点之间连锁较紧密,3个点所在区域极有可能是影响鸡生长发育的QTL区域。
单点关联分析表明,与各生长性状相关联(经验P＜l×10-4)的SNPs共有804个,Bonferroni校正后仍有77个位点与各生长性状呈显著关联(P＜2.04×10-6)。在1号染色体161459203-179667196区域存在大量的SNPs与体重性状关联显著,且有多个位点同时与多个体重性状以及胫长和胫直径性状都显著关联,特别是GGaluGA055291、rs13973515、GGaluGA055359和GGaluGA055379等4个位点与许多性状之间的关联呈极显著水平(P＜4.08×10-8),与屠体性状的结果相似,这一区域也存在大量与生长性状相关的QTLs,证实了结果的可靠性。
本实验利用芯片数据构建的连锁图谱总长为3224 cM。雌性、雄性和性别平均连锁图谱分别为2968.5 cM、2974.7 cM和2974.3 cM,Z染色体连锁图谱为249.8 cM,雌性连锁图谱与雄性图谱差异不显著。大染色体的平均重组率约为2.5 cM/Mb,而小染色体的重组率明显要比大染色体的大,为3.3-12.6 cM/Mb。