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目的:养羊业是我国农业的重要组成部分,绵羊不但能提供肉制品,而且能为毛纺业提供优质的细羊毛原料,解决优质羊毛供应紧缺的局面。中国美利奴羊是我国最优良的细毛羊品种之一,羊毛从毛囊发育而来,其中次级毛囊的发育决定了羊毛的细度和经济价值,所以阐明羊毛毛囊发育机理至关重要。随着新一代测序技术的出现和发展,人们已经在细毛羊和绒山羊上做了很多研究,很多报道都针对这些miRNA参与毛囊发育的调控进行了研究,尤其是关于绵羊成年时期毛囊发育各阶段的miRNA的相关报道为本研究提供了良好的借鉴基础。前期研究表明,miRNA是一类内源性非编码单链RNA,在生长发育、生物学过程中起重要作用。因此,毛囊发育从胎儿期就已经开始,为阐明miRNA在细毛羊毛囊发育中的作用,本研究通过胎儿期各分枝阶段的皮肤毛囊的组织形态学观察,确定毛囊发育的关键时间节点,进一步通过miRNA组学研究,挖掘出对毛囊发育有调控作用的miRNA,并对关键miRNA进行功能研究,揭示miRNA调控次级毛囊发育的分子机理,为开展基因调控毛囊发育以及优质细毛羊的分子选育提供依据。方法:(1)选择胎龄45d、55d、65d、75d、85d、95d、105d、115d、125d、135d、145d的33只中国美利奴羊(新疆军垦型)胎羊,每个发育时期选取三只,采集体侧部皮肤组织,一份用于miRNA组学分析;另一份放入4%多聚甲醛保存,制作胎儿皮肤毛囊组织的石蜡切片,用于毛囊组织形态学观察。(2)应用Illumina HiSeq 2500 System测序平台进行miRNA组学分析,分析皮肤毛囊不同发育时期的差异表达的miRNAs,预测已知miRNA、保守miRNA和新的miRNA;进行靶基因预测、GO功能富集、KEGG pathway分析;筛选皮肤毛囊发育重要时期的关键miRNA。(3)应用qPCR对18个差异表达的miRNAs进行验证。(4)构建miRNA与靶基因的Psicheck-2 Luciferase双荧光素酶报告基因重组质粒,分别转染293T细胞,通过荧光素酶活性证明miRNA的靶基因。(5)培养绵羊原代皮肤成纤维细胞,通过转染miRNA模拟物与空白对照(NC),应用Western blot和QPCR确定miRNA对靶基因蛋白和mRNA的表达的调控作用。(6)利用PCR和DNA测序技术,检测了中国美利奴羊(新疆军垦型)和多胎萨福克共计260个个体在miRNA-377基因位点的遗传多态性。结果:(1)通过11个发育时期的胎儿皮肤毛囊组织形态学观察,发现胎儿第45d,皮肤表皮层、真皮层、皮下结缔组织逐渐开始发育;胎儿第55d,皮肤结构发育完全;65d时初级毛囊开始发育,形成囊泡并且逐渐增大,到75d时初级毛囊已经形成;胎儿第85d时次级毛囊开始发生,初级毛囊数量迅速增加。胎儿第105d时,在原始次级毛囊开始再分化次级毛囊。(2)计算85-145d的初级毛囊和次级毛囊密度,结果表明随着胎龄的增长而减小,次级毛囊密度随着胎龄的增长而增大。计算胎儿期85-145d S/P值随着胎龄的增加而逐渐增大。(3)通过miRNA组学分析,在绵羊胎儿发育的11个时期共检测到了179个新的miRNAs和152个已知的miRNAs,其中37个差异表达miRNAs与次级毛囊形态发生相关。(4)采用MEVv4.6进行层次聚类分析,11个毛囊发育期中差异表达的miRNA分为2大类和4个亚类,其中2大类包括胎儿期45-95d的初级毛囊和次级毛囊发育关键时期,以及105-145d的毛囊发育增速时期;四个亚类包括45d、55d和65d的毛囊发育期,75、85和95d的毛囊发育期,105、115和125d的毛囊发育期,135和145d的毛囊发育期。聚类分析结果与毛囊(HF)生长发育的关键时期一致。(5)在75-85d的次级毛囊发育期,共有37个差异表达miRNA,其中上调表达miRNA 19个和下调表达miRNA18个,在次级毛囊发育关键期,novel-126极显著下调表达,miR-196b极显著上调表达。(6)经过GO和Pathway分析,证明PRL信号通路和血小板活化通路在次级毛囊形成过程中起重要作用,oar-miR-133、oar-miR-376c-3p、miR-196b*、miR-2285Ⅰ、miR-504、miR-873、Novel-8*、Novel-17、Novel-20、Novel-64基因参与次级毛囊发育。(7)通过双荧光素酶报告系统证明miRNA767模拟物和DDX5野生型质粒共转染293T细胞能显著抑制荧光素酶的活性(P<0.05),初步说明miR-767能调节DDX5基因的表达,miR-767的靶基因是DDX5基因;oar-miR-377模拟物和SLC24A2野生型质粒共转染293T细胞能显著抑制荧光素酶的活性(P<0.05),初步说明oar-miR-377能调节SLC24A2基因的表达,oar-miR-377的靶基因是SLC24A2基因。(8)通过NC和miRNA模拟物分别转染绵羊皮肤成纤维细胞,Western Blot和QPCR检测结果表明,miR-767显著降低DDX5蛋白和mRNA表达量;oar-miR-377显著降低SLC24A2蛋白和mRNA表达量。(9)通过PCR测序证明oar-miR-377核心序列上游276bp检测到T>C碱基突变,在中国美利奴羊(新疆军垦型)和多胎萨福克品种中分布。通过建立线性模型结果显示,基因型效应对细度离散系数存在显著相关(P<0.05),品种效应与毛纤维直径、细度标准差、细度离散系数存在极显著相关(P<0.01)。关联分析表明CC基因型个体的羊毛纤维直径大,细度离散系数极显著大于TT基因型个体(P<0.01)。综上所述,本研究证明85d为中国美利奴羊次级毛囊发育的关键时期;PRL信号通路和血小板活化通路在次级毛囊形成过程中发挥着重要作用。oar-miR-133、oar-miR-376c-3p、miR-196b*、miR-2285l、miR-504、miR-873、Novel-8*、Novel-17、Novel-20、Novel-64基因是次级毛囊发育的关键基因,miR-767和oar-miR-377均通过转录后分别下调DDX5和SLC24A2基因表达,进而促进次级毛囊发育。oarmiR-377的CC基因型个体的羊毛纤维直径大,因此,在细毛羊育种中选择TT和TC基因型个体。