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研究背景硬皮病(scleroderma)是一种细胞外基质(extracellular matrix, ECM)过度合成并沉积于皮肤和内脏器官,造成组织器官纤维化硬化,出现功能障碍的结缔组织病。根据有无内脏器官累及,本病分为局灶性硬皮病(localized scleroderma,LS)和系统性硬化(systemic sclerosis, SSc),其中,系统性硬化又按受累范围、程度、进展速度及预后等,分为肢端型系统性硬化(limited cutaneous systemic sclerosis, lcSSc)及弥漫型系统性硬化(diffuse cutaneous systemic sclerosis, dcSSc)。虽然大部分患者病情发展缓慢,但出现四肢皮肤受累而导致指端反复破溃或关节功能障碍者,其日常生活和工作则受到严重的影响；若累及颜面部皮肤,患者会因美观受到影响而心理负担加重。虽然国内外学者对硬皮病的发病机制及治疗进行了大量的研究,取得了较大的进展,但至今仍无特异性药物治疗皮肤硬化,也无法有效控制病情的反复。因此深入研究疾病机制,积极寻找治疗硬皮病的新靶点具有重要的社会意义。S100A9是S100钙结合蛋白家族中的重要一员,主要由髓系来源细胞如单核细胞,中性粒细胞和分化早期的巨噬细胞分泌,与机体固有免疫功能有关。研究发现S100A9是中性粒细胞的强力趋化剂,能促进各类细胞分泌炎症因子,在炎症反应过程中发挥着重要的作用,与多种炎症性和自身免疫性疾病关系密切。目前关于硬皮病与S100A9的研究不多,我们通过基因谱芯片扫描发现硬皮病模型鼠皮肤组织中S100A9基因表达明显升高。然而,国内外对S100A9在硬皮病的发病过程中是否有致病作用,尚未得到公认,值得进一步探讨。研究目的明确硬皮病患者外周血和皮肤组织中S100A9的表达水平,探讨其与疾病活动性的关系。观察S100A9如何参与博来霉素诱导性小鼠皮肤纤维化的发生发展,明确S100A9是否具有致纤维化的作用。在硬皮病患者皮肤成纤维细胞中研究S100A9对细胞增殖、炎症因子分泌及胶原合成的影响,探讨S100A9活化成纤维细胞的可能机制。研究内容与方法第一部分：收集26例局灶性硬皮病患者(LS)、31例肢端型系统性硬化患者(lcSSc)、57例弥漫型系统性硬化患者(dcSSc)和54例正常人的血样。运用ELISA方法检测血浆中S100A9的含量,并与患者的临床实验室检查指标进行相关分析；用real-time PCR方法检测外周血细胞中S100A9的mRNA表达量；免疫组化法测定皮肤组织中S100A9及其相应受体RAGE的表达和分布情况。第二部分：C57BL/6小鼠背部皮下注射不同剂量博来霉素(0.2mg/ml或0.3mg/ml,100μl),每日上午一次,连续注射三周。取局部病变皮肤组织,用HE染色和Masson特殊染色鉴定小鼠皮肤病变情况,观察各组小鼠皮肤纤维化程度。构建稳定的硬皮病小鼠模型,取造模1、2、3周的小鼠皮肤组织,用real-time PCR和Western blot法检测皮肤组织中S100A9含量的变化趋势。每日上午给予小鼠背部皮下注射低剂量博来霉素(0.2mg/ml,100μl)、每日下午在小鼠皮肤同一部位注射S100A9蛋白(0.5gg),每日一次,三周后处死小鼠。通过HE染色和Masson特殊染色观察不同组别小鼠病变皮肤组织病理变化,RT-PCR检测小鼠皮肤组织中炎症因子的表达水平,Western blot检测小鼠皮肤中a-SMA的含量,羟脯氨酸测试法测定皮肤中胶原含量的变化。给予C57BL/6小鼠不同剂量S100A9蛋白(0.1μg,0.25μg,0.5μg)皮下注射,每日一次,连续三周,通过HE染色和Masson特殊染色观察S100A9单独对小鼠皮肤组织的影响,评价皮肤中炎症因子、a-SMA和胶原表达的变化。第三部分：收集系统性硬化患者病变皮肤组织,分离原代成纤维细胞,用不同浓度S100A9刺激细胞不同时间,分别用CCK8和BrdU法检测细胞的增殖率；以real-time PCR和ELISA法测定细胞表达炎症因子IL-6、IL-8、IL-1β和HMGB1的水平；细胞划痕实验观察S100A9对成纤维细胞迁移能力的影响；Western blot评价细胞中胶原、α-SMA、RAGE表达情况以及ERK1/2MAPK或NF-κB信号通路的活化情况。为了进一步探索S100A9活化成纤维细胞的具体机制,分别应用抗RAGE抗体、抗TLR4抗体、ERK1/2MAPK通路抑制剂或NF-κB通路抑制剂预先处理细胞,再给予S100A9刺激细胞,检测细胞增殖率、上述炎症因子分泌水平和细胞表达胶原、a-SMA. RAGE水平的变化；进一步检测博来霉素诱导性硬皮病模型鼠的皮肤组织中ERK1/2MAPK、NF-κB信号通路活化情况,与S100A9处理组相比较,通过体内研究验证该机制。结果第一部分：1.与正常对照组相比,dcSSc患者血浆S100A9水平明显升高。伴有肺部累及或肌肉累及或肾脏累及的dcSSc患者血浆S100A9水平明显高于无肺部累及或肌肉累及或肾脏累及的患者；抗Scl70抗体或抗组蛋白抗体或抗U1RNP抗体阳性的dcSSc患者血浆S100A9水平均高于上述抗体阴性组患者。2.三种类型硬皮病患者外周血细胞中S100A9mRNA表达量均高于正常对照组,dcSSc患者S100A9mRNA水平较LS、1cSSc患者显著升高。3.免疫组化染色显示硬皮病患者皮肤真皮组织中有大量炎症细胞浸润,这些炎症细胞高表达S100A9；表达S100A9或其受体RAGE的成纤维细胞亦显著增多。第二部分：1.与生理盐水组相比,高剂量博来霉素可明显诱导小鼠背部皮肤纤维化,皮肤厚度增加,胶原沉积增多,低剂量博来霉素不能有效诱导小鼠背部皮肤发生硬皮病样改变。高剂量博来霉素造模1、2、3周后,硬皮病模型鼠皮肤组织中S100A9水平逐渐增高,显著高于生理盐水对照组。2.将S100A9与低剂量博来霉素同时给药,发现S100A9明显促进低剂量博来霉素诱导小鼠背部皮肤发生纤维化硬化,皮肤厚度显著增加,皮肤内炎症因子、胶原、α-SMA表达增多,两者协同的促纤维化效应更强于高剂量博来霉素注射组小鼠。3.与对照组小鼠相比,S100A9皮下注射三周后,可明显促进小鼠背部皮肤真皮层内炎症细胞浸润增多,炎症因子表达增加：高剂量S100A9处理组小鼠皮肤厚度增厚,低、中剂量S100A9处理组小鼠皮肤厚度改变不明显。第三部分：1.与对照组细胞相比,S100A9对成纤维细胞有明显的促增殖作用；S100A9可显著上调成纤维细胞分泌炎症因子,并促进细胞表达胶原、α-SMA和RAGE增加；S100A9可活化细胞内的ERK1/2MAPK和NF-κB信号通路。2.抗RAGE抗体、ERK1/2MAPK通路抑制剂和NF-κB通路抑制剂可以明显下调S100A9诱导成纤维细胞增殖和分泌炎症因子的作用,而抗TLR4抗体对S100A9的刺激无阻断作用。3.与低剂量博来霉素组相比,S100A9与低剂量博来霉素同时给药可显著增强小鼠皮肤组织中ERK1/2MAPK和NF-κB的磷酸化,并促进受体RAGE在皮肤中的表达。研究结论1.S100A9在系统性硬化患者血浆和皮肤中表达升高,且血浆蛋白含量与脏器累及和免疫学指标异常有明显相关性,提示患者体内存在着显著的炎症免疫反应异常。2.S100A9蛋白可加重博来霉素诱导的小鼠皮肤纤维化硬化,单独运用可诱导小鼠皮肤内炎症因子表达增多和皮肤增厚,具有一定的致纤维化性。3.S100A9可明显上调成纤维细胞的活性,具有促炎、促纤维化的作用,其作用机制是通过受体RAGE和ERK1/2MAPK、NF-κB信号通路介导的。因此,S100A9在硬皮病皮肤纤维化的发病过程中发挥着重要作用。