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背景： 近年来，随着冠状动脉搭桥术、经皮冠状动脉腔内成形术、冠状动脉溶栓疗法、心脏体外循环、心脏移植等方法的建立和推广应用，使众多的心血管疾病得到了有效治疗，但是由此引发的心肌缺血再灌注损伤（MI/RI）却严重威胁患者的预后。据统计，即使经过冠脉再通治疗，心电图ST段抬高型急性心肌梗死（STEMI）患者一年后的死亡率仍然达到7%，心衰的发病率高达22%。因此，尽早恢复缺血心肌血供的同时尽可能减小MI/RI已成为目前治疗急性心肌梗死亟需解决的一个关键问题。 线粒体是心肌细胞生成活性氧（ROS）的主要细胞器，缺血心肌细胞线粒体内ROS暴发性生成是引起MI/RI的重要原因。白藜芦醇是一个抗氧化剂，能够减少H2O2诱导的大鼠H9c2心肌细胞凋亡，减弱大鼠离体心脏缺血再灌注引起的线粒体损伤，减小心肌梗死面积，具有明确的心脏保护作用。但是白藜芦醇难溶于水，在人体内分布无选择性，代谢迅速，半衰期只有8~14min，口服生物利用度较低。因此，构建针对缺血心肌细胞线粒体的主动靶向递药系统，将白藜芦醇直接靶向递送到缺血心肌细胞线粒体，在防治MI/RI中将发挥重要作用。 IMTP（ischemicmyocardium-targeted peptide）是一个由9个氨基酸（Ac-CSTSMLKAC）组成的缺血心肌细胞靶向环状多肽，能选择性地与缺血心肌结合，可以作为递药系统中缺血心肌组织靶向配体，使递药系统更多的聚集在缺血心肌组织。SS-31是Szeto-Schiller（SS）肽家族中的一员，水溶性好。SS-31跨膜转运没有饱和性，能够迅速通过线粒体外膜，富集于线粒体内膜，并进入线粒体基质。除此之外，SS-31等电点为10.4，在内涵体或溶酶体酸性环境中，SS-31带三个正电荷，因此SS-31对内涵体膜及溶酶体膜具有很强的穿透能力，可协助递药系统从内涵体或溶酶体逃逸。综上所述，SS-31是一个理想的线粒体靶向肽。 目的： 本研究以缺血心肌细胞靶向肽（IMTP）和线粒体靶向肽（SS-31）为靶向配基，以白藜芦醇（RES）为ROS清除剂，构建具有层级响应的线粒体靶向PLGA纳米粒（MCTD-NPs）。该纳米粒能够依次对缺血心肌组织、溶酶体以及线粒体产生敏感响应，分别在细胞及亚细胞水平上呈现主动靶向特性，提高对缺血心肌细胞线粒体的靶向性，将白藜芦醇递送至缺血心肌细胞线粒体，改变白藜芦醇在体内和亚细胞器中的分布，靶向防治MI/RI。 方法： 1.合成pH敏感的腙键连接物IMTP-PolyHis-PEG3400-hyd-PLGA，应用纳米沉淀法制备层级响应线粒体靶向白藜芦醇纳米粒MCTD-NPs。 2.通过改变材料/药物投料比和两种靶向肽修饰材料的比例筛选出MCTD-NPs的最优制备处方。 3.通过测定粒径、zeta电位、载药量和稳定性等，对MCTD-NPs进行表征。 4.采用高效液相色谱（HPLC）法测定MCTD-NPs在释药介质[PBS（pH7.4）缓冲盐∶乙醇（v/v=40∶1）混合液]中的释药特性。 5.建立体外H9c2心肌细胞缺氧/复氧（H/R）模型；通过MTT法和LDH释放法测定MCTD-NPs的抗H/R损伤活性；应用HPLC和激光共聚焦显微镜（CLSM）观察H/R损伤H9c2心肌细胞对MCTD-NPs的摄取；通过CLSM观察MCTD-NPs在H/R损伤H9c2心肌细胞中的动态分布；通过测定细胞内ROS和线粒体内ROS，观察MCTD-NPs对H/R损伤H9c2心肌细胞中ROS的清除作用；通过测定mPTP的开放和线粒体膜电位，观察MCTD-NPs对H/R损伤H9c2心肌细胞线粒体功能的影响；通过测定caspase3活性观察MCTD-NPs对H/R损伤H9c2心肌细胞凋亡的影响。 6.通过western blot法测定MCTD-NPs对H/R损伤H9c2心肌细胞中STAT3、SOD2、cyt c、bax、caspase3等蛋白表达的影响。 7.建立大鼠MI/RI模型；通过监测血流动力学指标观察MCTD-NPs对MI/RI大鼠心功能的影响；通过伊文思蓝/2,3,5-三苯基氯化四氮唑（TTC）染色观察MCTD-NPs对MI/RI大鼠心肌梗死面积的影响；通过自动生化分析仪分析MCTD-NPs对MI/RI大鼠血清中肌酸激酶同工酶（CK-MB）、乳酸脱氢酶（LDH）和天冬氨酸转氨酶（AST）的影响；通过酶联免疫吸附法观察MCTD-NPs对MI/RI大鼠血清中肌钙蛋白I（cTnI）的影响；通过TUNEL染色观察MCTD-NPs对MI/RI大鼠心肌细胞凋亡的影响；通过光学显微镜和透射电子显微镜（TEM）观察MCTD-NPs对MI/RI大鼠心肌组织形态的影响；通过小动物活体成像仪观察MCTD-NPs在大鼠心脏中的分布。 结果： 1.通过核磁共振氢谱（1H NMR）和质谱（MS）确定所合成的化合物为目标化合物。 2.采用纳米沉淀法制备MCTD-NPs。当SS-31-PEG8-PLGA和IMTP-PolyHis-PEG3400-hyd-PLGA投料比为4∶6，材料和RES投料比为10∶4时，所制备的MCTD-NPs平均粒径为91.8nm，平均zeta电位为-11.8mV，平均载药量为11.7%。TEM观察MCTD-NPs为球形。MCTD-NPs在释药介质[PBS（pH7.4）缓冲盐∶乙醇（v/v=40∶1）混合液]中，48h内释放90%以上的药物。 3.MTT结果显示，缺氧3h/复氧4h时，H9c2心肌细胞存活率合适，适合于后续实验研究；LDH和MTT测定结果显示RES浓度为100μmol/l时，MCTD-NPs对于H/R损伤H9c2心肌细胞表现出最强的保护作用；摄取实验结果显示MCTD-NPs能够显著提高H/R损伤H9c2心肌细对RES的摄取；2-脱氧-D-葡萄糖、蔗糖、秋水仙素和IMTP能够显著抑制H/R损伤H9c2心肌细胞对MCTD-NPs的摄取，提示H/R损伤H9c2心肌细胞主要是通过网络蛋白和巨胞饮的方式摄取MCTD-NPs，IMTP介导了H/R损伤H9c2心肌细胞对MCTD-NPs的摄取；CLSM结果显示，与对照纳米粒（PLGA-NPs）相比，MCTD-NPs能够更快地从溶酶体逃逸，并且更多的分布在线粒体中；细胞内ROS和线粒体内ROS测定结果显示，MCTD-NPs能够增加RES清除ROS的能力；mPTP开放测定结果显示，MCTD-NPs能够降低mPTP的开放，与RES相比具有显著差异；JC-1染色结果显示与游离RES和PLGA-NPs相比，MCTD-NPs维护H/R损伤H9c2心肌细胞线粒体膜电位的作用最强；Caspase3活性测定结果显示，与游离RES组和PLGA-NPs组相比，MCTD-NPs处理组心肌细胞caspase3活性最低，说明MCTD-NPs抑制心肌细胞凋亡的作用最强。 4.Westernblot测定结果显示，MCTD-NPs能够上调H/R损伤H9c2心肌细胞线粒体中p-STAT3和cyt c蛋白的表达，下调H/R损伤H9c2心肌细胞线粒体中ace-SOD2和bax蛋白的表达；MCTD-NPs能够上调H/R损伤H9c2心肌细胞胞浆中p-STAT3、bax和caspase3蛋白的表达，下调H/R损伤H9c2心肌细胞胞浆中cleaved-caspase3和cyt c蛋白的表达；MCTD-NPs能够提高H/R损伤H9c2心肌细胞中SOD2的活性。5.血流动力学测定结果显示，当RES剂量为10mg/kg时，与RES给药组和PLGA-NPs给药组相比，MCTD-NPs改善±dp/dtmax、心率（HR）和左心室收缩末期压（LVESP）的作用更强；血清酶学测定结果显示，与RES给药组和PLGA-NPs给药组相比，MCTD-NPs给药组大鼠血清中CK-MB、LDH、AST和cTnI的浓度最低；心梗面积测定结果显示，MCTD-NPs能够显著降低MI/RI大鼠的心梗面积；形态学观察结果显示，与MI/RI模型组相比，MCTD-NPs给药组心肌组织坏死面积明显减少，心肌组织纹理清晰，少见心肌细胞肿胀及细胞间质水肿，胞浆染色均匀，出现少量炎性细胞浸润，大鼠心肌细胞线粒体数量明显增多，肿胀线粒体体积缩小，嵴排列基本有序，未见明显肿胀、溶解或空泡化的线粒体；TUNEL测定结果显示，与RES和PLGA-NPs相比，MCTD-NPs显著降低了MI/RI大鼠心肌细胞凋亡率；体内分布实验结果显示MCTD-NPs主要分布在大鼠缺血心肌组织中，并且能够渗透进入深层缺血心肌组织。 结论： MCTD-NPs具有明显的缺血心肌细胞线粒体靶向性，能够增加RES在缺血心肌组织及缺血心肌细胞线粒体中的分布，增强了RES对H/R损伤H9c2心肌细胞以及MI/RI大鼠心肌的保护作用，减少了MI/RI大鼠的心肌梗死面积，提高了MI/RI大鼠的心脏功能，这种保护作用与线粒体STAT3蛋白磷酸化、提高SOD2活性、增强心肌细胞的抗氧化能力有关。本课题为研究和探讨缺血心肌靶向给药系统提供了实验依据，为MI/RI的防治探索了新思路和新方法。