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目的探讨不同微泡(microbubble,MB)剂量、机械指数(mechanical index,MI)和超声辐照时间对诊断超声联合MBs开放小鼠血脑屏障(blood-brain barrier,BBB)的影响,优化参数增加BBB通透性,减少脑组织损伤,同时观察参数优化后BBB通透性的变化规律,并对其可能的机制进行初步探索。方法1.采用薄膜水化法和机械振荡法制备脂质MBs,显微镜观察形态并计数浓度,粒度分析仪测量粒径及分布,评价MBs稳定性,并观察其在小鼠心腔内增强显影效果。2.采用诊断超声系统在flash模式下,以不同的MB剂量、MI和超声辐照时间辐照小鼠纹状体区,伊文氏蓝(Evans Blue,EB)染色定性与定量评价BBB开放情况,HE染色评价脑组织损伤情况,筛选出最优实验参数。Western blotting和组织免疫荧光染色检测BBB开放前后紧密连接(tight junction,TJ)相关蛋白ZO-1、occludin和claudin-5的表达情况,透射电子显微镜(transmission electron microscopy,TEM)观察TJs超微结构的改变。3.EB染色定性与定量评价参数优化后BBB通透性变化规律,western blotting和组织免疫荧光染色检测BBB开放后不同时间点TJ相关蛋白ZO-1、occludin和claudin-5表达水平的变化。HE染色评价BBB开放对小鼠主要器官的影响。结果1.自制MBs呈中央半透亮的球形,浓度为(3.63±0.11)×10~9MBs/ml,平均粒径为1546.8±114.2nm,制备后6小时内粒径和浓度相对稳定,能够显著持续增强小鼠心腔显影,半衰期为(2.97±0.54)分钟。2.随着MB剂量、MI和辐照时间增加,脑组织EB渗出量增加,蓝染程度增加。MI小于等于0.4时,未见明显组织学损伤;当MB剂量增加到1.0×10~7MBs、MI增加到0.8或辐照时间增加到3分钟时,仅见少量散在红细胞或小片状红细胞渗出;MB剂量为2.0×10~7MBs或辐照时间为4分钟时,红细胞渗出量增加,受损血管周围可见散在深染的缺血或凋亡神经细胞,神经纤维网轻度空泡样变性。MB剂量为3.0×10~7MBs时,可见明显广泛红细胞渗出,伴随着神经细胞显著减少,神经纤维网急性退行性变。BBB开放后三种TJ相关蛋白表达水平均明显下降,同时TEM观察到TJs开放。3.超声辐照后0小时脑皮质及纹状体区BBB通透性最高,分别于6小时和4小时后恢复正常。三种TJ相关蛋白超声辐照后0小时表达水平迅速下降,6小时后恢复正常水平。除BBB开放6小时组小鼠脑组织有少量红细胞渗出外,其余时间点各器官均未见明显组织学损伤。结论1.成功制备了脂质MBs,具有浓度较高,粒径均一,稳定性较好,半衰期长,能够明显增强体内显影效果等特点。2.随着MB剂量、MI与超声辐照时间的增加,BBB开放程度增大,脑组织损伤的风险也随之增加。3.在GE Vivid E9超声诊断系统的实时引导下,超声频率为1.5/3.0MHz,MB剂量为1.0×10~7MBs,超声强度MI为0.8,超声辐照时间为3分钟,可以实现经颅、无创、可逆的开放较大范围的小鼠BBB。4.在上述实验参数下,脑皮质及纹状体区BBB开放持续时间分别为6小时和4小时。5.诊断超声联合MBs开放BBB后通透性的变化趋势与三种TJ相关蛋白表达水平的变化趋势基本一致。TJ相关蛋白ZO-1、occludin与claudin-5表达水平下降,引起TJs开放可能是诊断超声联合MBs开放BBB的作用机制之一。