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钙调磷酸酶(CN)是由催化亚基A(CNA)和调节亚基B(CNB)组成的异二聚体,是蛋白磷酸酶家族中唯一受Ca<2+>/钙调素(CaM)调节的Ser/Thr磷酸酶,它在几种细胞内信号转导通路中起关键作用,包括T细胞的激活.CN晶体结构揭示B亚基的C端与A亚基的N端在空间上接近.我们利用一对含有6个甘氨酸密码子的接头引物扩增了A、B两个亚基的融合基因,构建了单链型全酶(CNB-CNA,BA)的高效表达体,并且纯化了这种单链全酶.重组BA对特异性底物对硝基苯酚磷酸(pNPP)和磷酸化RⅡ肽表现了很高的磷酸酶活性,并且与天然牛酶具有相似的理化和动力学参数.它仍受CaM的激活,但不受外加CNB的调节,且活性仍受二价金属离子的强烈刺激.我们使用内源荧光光谱和圆二色谱在相同条件下对BA和牛酶的溶液构象进行了检测,结果显示两者谱线高度一致,尤其在Ni<2+>存在下.根据以上结果我们认为,钙调磷酸酶A、B两个亚基的融合并没有影响到它们各自的折叠途径以及涉及它们功能的结构变化,并且它们在正确的空间位点得以结合.我们的结果进一步验证了蛋白质一级结构决定高级结构的理论.在CNB抗肿瘤前期实验结果基础上,为探讨CNB抗肿瘤机制及是否可以作为基因治疗药物,我们将CNB、IL-2、IL-6、IFNa2b和HIV-1 gp120基因克隆入真核瞬时表达载体pIRES1neo,构建了五种转基因重组质粒,对正常和H22、S180致敏小鼠的脾细胞、巨噬细胞及U937细胞进行了细胞转染,并检测了转染细胞对肿瘤细胞的杀伤效应和脾细胞在ConA存在下的增殖效应.结果显示:在ConA刺激下,转染CNB基因的S180致敏脾细胞增殖效果最为显著;H22致敏脾细胞效果强于IFNa2b,但弱于IL-2和IL-6;正常脾细胞无作用,但IL-2、IL-6效果显著.转染CNB基因的脾细胞和巨噬细胞均对S180杀伤效果显著,与细胞因子组内比较,S180致敏的巨噬细胞以CNB效果最为显著,S180致敏的脾细胞以CNB和IL-2效果最为显著.转染CNB基因的U937细胞对7种靶细胞具有不同的杀伤效应,以对A549和HeLa细胞的杀伤效应最为显著;对A549杀伤效应的组内比较,CNB效果明显高于三种细胞因子;对HeLa杀伤效应的组内比较,以CNB和IFNa2b效果最为显著.通过对以上结果分析和总结,我们认为:(1)在Con A刺激下,转染CNB基因的S180致敏脾细胞增殖效果最为显著;H22致敏脾细胞和正常脾细胞无作用.(2)转染CNB基因的脾细胞和巨噬细胞均对S180杀伤效果显著.(3)转染CNB基因的U937细胞对7种靶细胞具有不同的杀伤效应,以对A549和HeLa细胞的杀伤效应最为显著.(4)通过对以上结果分析和总结,我们认为,CNB作为基因治疗药物具有可行性;CNB抗肿瘤机制具有复杂性,不能通过简单的表面现象来解释.