链霉菌分化相关基因(whiI、inoA)及谷氏菌素生物合成基因簇异源表达的研究

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开展链霉菌发育分化的研究对揭示生命现象具有重要的理论意义,同时对次级代谢产物的生物合成研究具有潜在的应用前景。  本论文主要获得如下结果:  1.inoA可以作为报告基因来检测目的启动子的转录及表达情况。inoA阻断突变株在基本培养基上呈基质菌丝的光秃型表型,而在培养基中添加肌醇可使突变株恢复气生菌丝生长及产孢。本工作利用inoA影响分化的特性,构建了以沉默的cpkO启动子(PcpkO)驱动inoA转录的报告质粒,将该报告质粒通过接合转移转入天蓝色链霉菌inoA/scbR2双突变株中。由于ScbR2的缺失,使其对PcpkO盼抑制被解除,从而使报告质粒中PcpkO可以启动inoA的转录,并使双突变株在无肌醇添加的基本培养基上恢复野生型产孢表型。本工作首次报道inoA可以用作报告基因来检测目的基因启动子的表达,同时还有望在隐性基因簇的研究中发挥其重要的作用。  2.inoR是WhiI直接的靶基因。前期转录组数据显示,天蓝色链霉菌发育分化关键调控因子WhiI能够影响包括sco3900(inoR,编码PadR类负调控蛋白)及与其毗邻的sco3899(inoA,编码肌醇-1-磷酸合成酶,是肌醇生物合成途径中的限速酶)在内的45个基因的转录,与野生型相比whil突变株中inoR及inoA在孢子成熟阶段的转录水平未表现出明显的上调,表明inoRA受到WhiI的调控。在本研究组发现了InoR对自身启动子(PinoR)有直接的负调控作用的基础上,本论文工作通过EMSA分析,发现WhiIC端DNA结合结构域(WhilC)也能够特异性结合PinoR,DNAfootprinting实验显示WhilC在PinoR上有两个结合位点,其中之一与InoR在PinoR上的结合位点有重叠,这就暗示WhiI结合PinoR后可以解除InoR对自身表达的抑制,从而对inoR表达起激活作用,这也同前期转录分析数据一致。  3.链霉菌看家基因hrdB的启动子可以作为一个组成型启动子用于抗生素增产。本工作首先构建了不含有调控基因的谷氏菌素生物合成基因簇(pGouA-N),进而将其中重要结构基因启动子通过PCRtargeting的方法更换为hrdB启动子(PhrdB),分别得到pGouh-AMN和pGouh-AMLN,将三个质粒分别接合转移天蓝色链霉菌M1146,得到M1146-A-N、M1146-h-AMN和M1146-h-ALMN。发酵结果显示,更换启动子可以使禾粟链霉菌的谷氏菌素生物合成基因簇在模式菌株天蓝色链霉菌异源表达产量提高至更换启动子前的5-10倍。进一步的转录分析结果显示,与M1146-A-N相比,M1146-h-AMN和M1146-h-ALMN中gouA、gouB、gouG、gouL、gouM和gouN的转录量均有显著提高。上述结果显示,PhrdB可以作为一个组成型启动子用于抗生素产量提高及高表达目的基因的研究。
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