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细胞凋亡是一种程序性、生理性和主动性细胞死亡方式，因有与坏死明显不同的形态学特征及生化改变而命名。在所有多细胞生物体的发育及稳态维护方面起了重要作用，通过凋亡，生物体能祛除过剩、有害和衰老的细胞，维持机体正常的细胞数量和结构。人体中，过度凋亡或凋亡不足均能导致严重后果。有遗传病变的细胞不能发生凋亡促成了肿瘤的发生，现已明确肿瘤的发生发展不仅与肿瘤的高增殖性有关，而且与肿瘤细胞的凋亡机制障碍、凋亡耐受关系更密切。细胞凋亡通路中关键基因的突变使肿瘤细胞可在没有生长刺激信号的情况下疯长，并能逃避宿主免疫反应。而且，逃避凋亡的能力也使肿瘤细胞能无限制地复制，侵犯邻近和远处组织，并导致了治疗耐受。 研究发现，细胞凋亡的特征性形态学和生化改变是由半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspase)家族所介导。正常情况下caspase以无活性的酶原形式存在于胞浆中，细胞受凋亡刺激后可经过蛋白酶水解将其加工成活性态。活化的效应性caspase可裂解多种底物，包括酶和细胞骨架蛋白如纤层蛋白，导致细胞有序解体。目前，两条活化caspase的信号传导通路已确立和阐明，根据通路的切入点不同，分别称为死亡受体和线粒体通路。细胞凋亡可以经过外源性通路和/或内源性通路，具体取决于肿瘤细胞类型、肿瘤细胞与周边的关系以及所处的微环境等因素。 我们在前期研究中已证实氟尿嘧啶可诱导肝癌细胞凋亡，外源性信号传导通路参与了这一过程。但对氟尿嘧啶是否亦经内源性通路诱导肝癌细胞凋亡，两条通路在该肝癌细胞凋亡中的地位以及相互之间是否存在联系，目前尚不清楚。为此，本实验欲利用所建立的氟尿嘧啶体外诱导肝癌细胞凋亡的模型，通过研究caspase-9的活化及其活性变化，分析线粒体蛋白细胞色素C和 Smac川 在线粒体和胞浆中的分布情况，以确定氟尿唆陡是否经内源性通路诱导肝癌细胞凋亡。同时，使用特异的启动性caspase抑制剂分别阻断内源性和外源性通路的上游，探讨两条通路在氟尿喷陡诱导肝癌细胞凋亡中的作用以及相互关系。本研究将为建立化疗诱导肝癌细胞凋亡的信号传导通路图奠定基础，并有助于了解化疗作用以及化疗耐受的确切分子机制，还将为优化化疗方案、改善化疗疗效、克服化疗耐药和寻找新的肿瘤治疗靶点和策略提供实验和理论依据。 本实验分为两部分，第一部分：氟尿喷陡诱导肝癌细胞凋亡的内源性信号传导通路的研究；第二部分：内、外源性信导通路在氟尿啼陡诱导肝癌细胞凋亡中的作用。 第一部分 氟尿啼睫诱导肝癌细胞凋亡的内源性 凋亡信号传导通路的研究 目的 检测氟尿啼睫团uorouracil，5Iu）诱导肝癌细胞凋亡过程中caspase个的活化及其活性变化，分析线粒体蛋白细胞色素C和Smaco 在线粒体和胞浆中的分布情况，以确定氟尿喀陡是否经内源性通路诱导肝癌细胞凋亡。 方法 用 IX 10一、 的氟尿嚼徒处理 HepGZ细胞，分别作用 2、4、8、16、24 J＼时，用荧光检测试剂盒测定 HePGZ细胞凋亡过程中caspase－9的活性变化，Western－blot检狈 caspase－9前体蛋白酶水解裂解活化后产生的小亚单位片段b10）；Western十 和间接免疫荧光法分析细胞色素C和 Smac川 蛋白在细胞中的分布情况；流式细胞仪检测加入caspase刁抑制剂后细胞凋亡百分率的变化。 结果 氟尿唆陡处理肝癌细胞4．J＼时后，caspase个活性开始升高，于16 小时后达到高峰，与空白对照组比较差异有显著性仰0．01）：同样，在药物处理4 ’J’时后，Western－blot检查发现即 且且有caspase今前体发生蛋白酶水解裂解后所形成的10KD片段条带，此蛋自条带随着药物作用时间的延长愈加明显，至16小时最清楚。Western－blot分析也显示经药物处理后细胞色素 C和 Smac／DIABLO在胞浆中的分布量从4小时后逐渐增加，相应的蛋白条带逐渐变清晰，至 16 J＼时最明显；而细胞色素C和 Smac／DIABLO在线粒体中的分布情况却正相反，蛋白条带由4小时最清楚，逐渐变淡，16小时最模糊。荧光显微镜下观察到，未加药物处理的对照组肝癌细胞中荧光呈点状或细块状分布，而药物处理的肝癌细胞从2小时开始，细胞中荧光逐渐变得越来越弥散，表明细胞色素 C和 Smac心 由局限于线粒体变成均匀分布于整个胞浆。使用caspase叫抑制剂后，肝癌细胞凋亡百分率明显下降，抑制剂组与氟尿唆陡组比较，差异有显著性k的．05），但抑制剂组16小时仍显著高于空白对照组km．05） 结论 在氟尿啼陡诱导肝癌细胞凋亡过程中caspase今被活化，活性显著升高；细胞色素C和 Smaco 自线粒体释放到胞浆，参与了caspase－9的活化；caspase－9抑制剂可部分阻断氟尿嚼陡诱导肝癌细胞凋亡。结果提示氟尿唆陡诱导肝癌细胞凋亡经过了内源性凋亡信号传导通路。 第二部分 内、外源性信导通路在氟尿啼睫诱导 肝癌细胞凋亡中的作用 目的 探讨氟尿啼陡诱导HepGZ细