【摘 要】
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背景:慢性髓细胞白血病（Chronic myeloid leukemia,CML）是源发于骨髓造血系统的一种恶性肿瘤性疾病,呈全球性分布,在我国中位发病年龄较西方年轻。其主要是由于特征性的BCR-ABL融合致癌基因的形成以及具有强酪氨酸激酶活性的BCR-ABL融合蛋白引起致病。目前首选的治疗药物为酪氨酸激酶抑制剂TKIs,在临床上取得非常好的疗效,但同时也面临一些新的挑战。其中由于慢性髓细胞治疗药
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背景:慢性髓细胞白血病（Chronic myeloid leukemia,CML）是源发于骨髓造血系统的一种恶性肿瘤性疾病,呈全球性分布,在我国中位发病年龄较西方年轻。其主要是由于特征性的BCR-ABL融合致癌基因的形成以及具有强酪氨酸激酶活性的BCR-ABL融合蛋白引起致病。目前首选的治疗药物为酪氨酸激酶抑制剂TKIs,在临床上取得非常好的疗效,但同时也面临一些新的挑战。其中由于慢性髓细胞治疗药物的靶点单一,耐药性的形成使慢性髓细胞白血病再次面临无药可医的境地,因此,进一步探索TKIs的耐药机制及发现新的靶点具有非常重要的意义。而其中的miR-149在许多肿瘤中被发现为一种抑癌基因,本研究主要对miR-149在慢性髓细胞白血病中的作用及其与TKIs的耐药性之间的关系进行进一步探索。目的:本研究主要从临床标本及CML细胞株入手,分别从体内、体外实验着重筛选耐药相关性差异miRNAs。之后在CML细胞株内进行进一步的体外功能实验,通过多种技术联合应用,从基因、蛋白质等多个层面对TKIs的耐药机制进行更深入的研究,发现miRNAs的潜在的治疗作用,为TKIs耐药寻找新的治疗靶点。方法:⑴根据相关临床指南,依照慢性髓细胞白血病患者对一代TKIs药物伊马替尼（IM）治疗反应的不同,筛选耐药及不耐药患者,收集相应临床标本,进行qRT-PCR实验,数据进行后续整理及统计分析。⑵通过IM浓度梯度诱导法构建IM耐药细胞株,用CCK8法检测K562及K562G细胞株IM半数抑制浓度IC50,计算两种细胞之间的耐药倍数,为后续实验奠定基础。⑶在前期成功构建的耐药细胞株K562G中,通过慢病毒转染构建miR-149基因过表达稳转细胞株及相应阴性对照细胞株,miR-149/OE及miR-149/NC。凋亡芯片也被用于转染后续的凋亡差异蛋白筛选,并进行GO及KEGG对差异蛋白进行亚细胞定位及通路富集等分析。⑷应用RNA干扰（RNAi）及慢病毒稳定转染等技术,通过对miR-149及SP1目的基因表达量的干预,将细胞分为K562及K562G组、miR-149/OE及miR-149/NC组、miR149 inhibitor及Inhibitor NC组、siRNA SP1及siRNA NC组,后续通过实时定量荧光PCR（qRT-PCR）、蛋白免疫印迹（WB）、流式细胞术等技术,进行体外功能分析,研究miR-149-SP1轴在IM耐药中的作用及分子机制。⑸应用统计学原理对数据进行描述及统计分析,结合生物信息学技术,对数据进行归纳整理及数据挖掘。结果:⑴临床标本部分:miR-149在CML不耐药组（最佳反应）中的表达明显高于耐药组（治疗失败）（P=0.000<0.001）及健康对照组（P=0.02<0.05）,且CML患者中miR-149的相对表达量与BCR-ABL融合基因的相对表达量之间呈明显的负相关（相关系数为-0.607,**P=0.000<0.01）。⑵细胞实验部分:（1）成功构建的IM耐药细胞株K562Gd的IC50值约为IM敏感在K562的50倍。qRT-PCR结果显示miR-149在IM耐药细胞株K562G中的表达明显低于IM敏感细胞株K562（P=0.00001<0.001）。（2）miR-149过表达及IM药物作用可协同诱导细胞凋亡。（3）凋亡芯片结果在miR-149/OE和miR-149/NC中筛选出22种差异蛋白,同时GO和KEGG提示这些差异蛋白在凋亡、坏死及药物耐药通路具有很高的富集。（4）SP1被预测为miR-149的靶基因,且miR-149与SP1在CML细胞系中的表达呈明显负相关（R2=-0.9377,P=0.03<0.05）,敲低SP1可影响细胞周期,使细胞周期阻滞在G1期,其与在K562G中过表达miR-149的作用相一致。结论:miR-149-SP1轴通过诱导细胞凋亡及细胞周期阻滞作用,在CML中发挥抑癌作用,与IM联用可比单用任一种具有更明显的抑制增殖作用,可能成为CML治疗潜在靶点。对CML耐药机制的研究,为临床提供了治疗新思路。
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