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重金属超积累植物的内生细菌不仅对重金属有很强的抗性作用,促进宿主植物的生长和提高宿主植物对生物与非生物胁迫的适应能力,很可能影响土壤重金属的生物地球化学循环。因此,通过优化超积累植物与其内生细菌的关系,是提高植物修复重金属污染土壤效率的可行途径之一。本论文首先从浙江衢州古老的铅锌矿区东南景天的根、茎、叶组织中分离和纯化内生细菌,从中筛选出具有促植物生长特性、能提高或降低土壤锌、镉有效性的Zn/Cd抗性菌株。进一步采用盆栽实验,一方面探讨接种能溶解锌、镉化合物的促生内生菌对东南景天生长、吸收和积累污染土壤中锌、镉的影响;另一方面探讨接种Zn/Cd抗性的促生内生菌是否能促进低积累植物玉米在锌、镉污染土壤上的生长,及降低玉米对锌、镉的吸收和积累。研究结果为今后重金属污染土壤的植物一微生物联合修复和安全利用技术提供菌种资源和理论依据。本论文取得的主要研究结果如下:
(1)从东南景天的根、茎和叶片中共分离和纯化11株对Zn、Cd均具有较高的抗性的内生细菌,其中菌株R1对锌的最大忍耐浓度为15 mmol·-1,菌株R1和R3对镉最大忍耐浓度为2 mmol·L-1。7株菌株(L1、L2、L3、L4、R1、R3、S2)具有较高的锌镉抗性和产生吲哚乙酸,3株(L3、R1、R3)能产铁载体。16S rDNA序列测定结果显示:三株为假单胞菌属(Pseudomonas),两株为朱斯特金黄杆菌属(Chryseobacterium),一株为鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)和一株为葡萄球菌属(Staphylococcus)。
(2)根据菌株在含难溶性化合物ZnO、ZnCO3、Zn3(PO4)2、CdO和CdCO3的SMS固体培养基上的生长情况,菌株L1、L4、R1和R3能够有效溶解上述5种化合物。其中菌株R1在含有5种化合物的培养基上菌落直径均最大,其产生的透明圈直径也均较大。在液体培养条件下,菌株L4、R1和R3能有效地溶解ZnO和ZnCO3,菌株L1、L4和R1可以溶解CdO。菌株R1对ZnO和ZnCO3的溶解率分别为74.0％和60.3%,培养液中Zn2+最高浓度分别达851.8 mg·kg-1和791.8 mg·kgq-1,培养液的pH值降低到5.82和5.32。菌株L4对CdO的溶解率是88.9%,培养液中Cd2+最高浓度为509.0 mg·kg-1,培养液的pH值降低到4.20。
(3)菌株L1、L4、R1、R3生长48 h后的培养物提取模拟CdO、ZnO、ZnCO3污染土壤和大宝山污染土壤中Zn和Cd。结果表明,菌株R3的培养物对模拟ZnO、ZnCO3和大宝山污染土壤中对Zn的提取量分别比去离子水和SMS培养基的高29.85～31.0 mg·kg、23.19～24.18 mg·kg-1和1.53～2.24 mg·kg-1,对模拟CdO和大宝山污染土壤中Cd提取量分别比去离子水和SMS培养基的高2.76～2.92 mg·kg-1和7.33～9.83μg·kg-1。菌株L1、IA、R1、R3分别接种到模拟锌污染土壤和大宝山污染土壤进行培育试验显示:土壤中水溶态Zn浓度先下降再上升再下降,培育至第14天时,模拟ZnO、ZnCO3污染土壤中水溶态Zn浓度为0.06～0.17 mg·kg-1,大宝山污染土壤为11.71～13.50 mg·kg-1;然而,4株菌株接种到CdO污染土壤和大宝山污染土壤后,培育过程土壤中水溶态Cd浓度变化不明显。
(4)采用盆栽试验研究接种菌株L1、L4、R1和R3对东南景天在模拟氧化镉、氧化锌和碳酸锌污染土壤上的生长、吸收和积累锌镉的影响。结果发现,在模拟氧化镉污染土壤中,菌株L1和R3促进了东南景天的对镉的吸收和转运,其根系和地上部镉含量分别比不接种对照增加13.8%～34.3%和30.1%～38.0%。接种菌株L1、L4、R1和R3后,土壤pH值降低,土壤有效镉含量比对照增加22.9%～32.4%;在模拟碳酸锌污染土壤中,接种菌株L1、L4、R1和R3促进东南景天的生长,其地上部干重比对照增加19.8%～48.5%,同时土壤的pH值略微降低,土壤有效态锌含量增加,其中接种菌株R3促进了东南景天对锌的转运,其地上部Zn含量比对照增加11.7%。
(5)采用盆栽试验研究接种菌株L1、L4、R1和R3对东南景天在大宝山矿山废水污染土壤上的生长、吸收和积累锌和镉的影响。结果发现,在赤泥+污泥改良的污染土壤中,菌株R1和R3显著促进了东南景天的生长,其根、茎、叶组织的干重分别比不接种对照增加19.8%～24.2%、31.2%～41.9%和56.8%～37.0%。接种菌株L1和L4后,土壤pH值降低,土壤有效Zn含量比对照增加61.1%和49.4%;同时,接种菌株L1、L4、R1和R3后,东南景天茎、叶的Zn含量分别比对照增加32.4%～39.2%和24.2%～34.6%,Cd含量分别比对照增加13.3%～86.8%和13.3%～19.3%。在未改良的和石灰+污泥改良的土壤中,接种菌株L1、L4、R1和R3后,土壤的pH值略微降低,土壤有效态锌、镉含量增加;其中接种菌株L1和R3使东南景天茎、叶组织中的Zn、Cd含量均有增加。
(6)将锌镉抗性促植物生长菌株Ⅱ2R3和Ⅳ8R3接种到模拟锌污染土壤上,研究其对玉米的生长、对锌的吸收和转运的影响。结果发现,在Zn添加量为200 mg·kg-1的土壤上,混合接种菌株Ⅱ2R3+Ⅳ8R3明显促进了玉米的生长,其地上部生物量比对照增加17.1%,土壤有效锌含量降低29.4%,第一季玉米地上部Zn含量比对照降低了14.3%;单独接种菌株Ⅱ2R3或Ⅳ8R3土壤中有效态锌含量也显著降低,但对东南景天的生物量和吸收Zn均没有显著影响。在Zn添加量为400 mg·kg-1的土壤上,接种菌株处理使土壤pH值升高,土壤中有效Zn含量降低,且接种菌株Ⅱ2R3、菌株Ⅳ8R3和混合接种菌株Ⅱ2R3+Ⅳ8R3后,第二季玉米地上部Zn含量分别比对照降低48.3%、49.7%和47.2%。在Zn添加量为800 mg·kg-1的土壤上,接种处理降低土壤的pH值和土壤有效Zn含量。混合接种菌株Ⅱ2R3+Ⅳ8R3使第一季玉米地上部和根系的干重比对照分别增加45.9%和55.8%,地上部和根系Zn含量分别比对照降低20.0%和51.7%,使第二季玉米地上部Zn含量下降68.7%;接种菌株Ⅱ2R3后,第一季玉米地上部和根系Zn含量均降低,第二季玉米地上部Zn含量比对照降低了69.8%;接种菌株Ⅳ8R3使第二季玉米的根系的干物质的量增加62.2%,地上部Zn含量降低60.9%,但是增加了土壤中有效zn含量。
(7)将锌镉抗性促植物生长菌株Ⅱ2R3和Ⅳ8R3接种到模拟镉污染土壤,研究其对玉米的生长和吸收转运镉的影响。结果发现,在Cd添加量为1 mg·kg-1的土壤上,混合接种菌株Ⅱ2R3+Ⅳ8R3促进了第二季玉米的生长,降低了对Cd的吸收和转运,地上部和根系Cd含量比对照分别降低43.3%和40.4%;接种菌株Ⅱ2R3后,第二季玉米地上部和根系Cd含量比对照分别降低40.0%和26.8%;接种菌株Ⅳ8R3后,两季玉米地上部和根系的干物质的量增加24.6%～27.0%和15.3%～21.3%,第二季玉米地上部和根系Cd含量分别降低13.3%和15.0%。在Cd添加量为5 mg·kg-1的土壤上,混合接种菌株Ⅱ2R3+Ⅳ8R3降低第一季玉米根系对Cd的吸收,根系Cd含量比对照减少了45.4%;单独接种菌株Ⅱ2R3或Ⅳ8R3促进了玉米的生长,其地上部和根系干物质的量比对照增加21.3%～28.2%和27.8%～61.7%,同时根系Cd含量比对照降低21.5%～65.6%。在Cd添加量为10 mg·kg-1。的土壤上,混合接种菌株Ⅱ2R3+Ⅳ8R3后,土壤pH值上升,土壤有效镉含量显著降低。第一季玉米地上部和根系的生物量分别比对照增加33.8%和40.4%,同时地上部Cd含量比对照降低20.7%。单独接种菌株Ⅱ2R3或Ⅳ8R3后,土壤有效Cd含量虽有降低,但第一季玉米根系镉含量比对照高99.8%～118%,第二季玉米根系镉含量也较高,达到38 mg·kg-1。
(8)将锌镉抗性促植物生长菌株Ⅱ2R3和Ⅳ8R3接种到大宝山矿山废水污染土壤上,研究其对玉米的生长和吸收转运重金属锌和镉的影响。结果发现,单独接种菌株Ⅱ21t3、Ⅳ8R3和混合接种菌株Ⅱ2R3+Ⅳ8113后,玉米地上部的干物质量分别比对照增加8.0%、14.4%和12.2%,地上部Zn含量比对照降低30.5%、41.9%和46.0%,但根系Zn含量反而比对照增加;接种菌株Ⅱ2R3和混合接种菌株Ⅱ2113+Ⅳ8R3后,玉米地上部的Cd含量分别比对照降低17.7%和58.8%;然而,接种菌株Ⅳ8R3使玉米地上部和根系Cd含量分别比对照增加52.9%和28.3%。
综上所述,超积累植物东南景天的内生菌均具有较高的锌镉抗性,体外试验表明,一些内生细菌具有促植物生长特性、增加或降低土壤中锌、镉有效性。盆栽结果进一步表明,菌株R1和R3能促进东南景天的生长及其对土壤中锌和镉的吸收和转运,为强化东南景天修复重金属污染土壤具有巨大应用潜力。另一方面,混合接种促生细菌Ⅱ2R.3+Ⅳ8R3不仅能有效促进低积累玉米在污染土壤上的生长,还能降低玉米中锌、镉含量,是今后重金属污染土壤的农业安全利用行之有效的一种新方法。