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研究背景近年来癌症已经成为危害人类健康的一大杀手。而在全球范围内肝癌是其中发病率和死亡率均较高的一种恶性肿瘤,而且中国又是肝癌的高发区域,且近年来肝癌的发生更呈现高发和早发的趋势。而目前为止肝癌的具体发病原因及机制尚未完全清楚,仅知道肝癌是一个多病因,多阶段,被多种机制调控的恶性肿瘤。研究资料表明,病毒感染、肝硬化、酒精、黄曲霉素、饮水污染、亚硝胺类物质以及微量元素等均与肝癌的发病相关,我们课题组主要研究酒精与肝癌的发展与转移的关系。饮酒不仅会增加患高血压、中风、心脏病等的风险,更是肝癌、结直肠癌、食管癌、乳腺癌等多种癌症的危险因素。在欧美国家,酒精是引发肝癌的第一大诱因。在中国,酒精是仅次于病毒性肝炎的肝癌的第二大诱发因素,且近年有增长的趋势。轻度的饮酒是癌症的轻度但并不重要的危害因素,而随着饮酒量的增加,其引发疾病的危险程度也会逐渐增加,因此重度饮酒确实是癌症一大危险因素。但是不同程度酒精导致肝癌的发展和转移的机制仍未明了。实验室前期研究发现慢性酒精摄入可以通过NF-γB通路促进肝癌的发展和转移,我们设想是否有其他通路。我们通过基因芯片发现酒精刺激的肝癌细胞中mi R-22显著升高,查阅文献以及荧光素酶报告基因显示TET2是mi R-22的下游靶基因。我的课题主要研究TET2的减少是否与实体肿瘤肝癌的发生和转移有关。TET2来源于TET家族,其家族成员有TET1,TET2,TET3,该蛋白家族是DNA的去甲基化酶,其可将5-mc脱甲基化为5-hmc,5-fc,5-cac。是其中DNA甲基化的异常也已经证实是癌症的标志。而近期发现TET的改变不仅与细胞的多能性有关,TET蛋白的减少与癌症的发生也有关。TET2位于4q24,研究发现TET2基因的突变广泛存在于血液系统的恶性肿瘤(如AML CMML,MPS),近年开始研究在实体瘤中研究,目前已有研究发现TET2的减少与乳腺癌肺癌等实体肿瘤的发生与发展有关。那么慢性酒精摄入是否是肝癌的危险因素,酒精是否能改变TET2的表达量呢?TET2与肝癌的发展与转移又有何关系呢?为了验证这一假说,我们首先通过收集临床资料分析得出有慢性饮酒史的肝癌病人相对于无饮酒史的病人血管转移率高,生存率较低,证实酒精促进肝癌的发展和转移。然后通过免疫组化发现在有慢性饮酒史的肝癌病人组织中TET2的表达明显低于无饮酒史的肝癌病人。接下来我们用体外实验进一步验证TET2对肝癌的影响。我们将si RNATET2转染进肝癌细胞进而敲低癌细胞中TET2的表达,进而通过细胞行为学来验证TET2敲低后细胞增殖和迁移能力的改变。研究方法1.临床收集肝癌病人并根据有无慢性饮酒史分为两组,并通过统计学方法来比较两组病人的预后及血管转移等情况。2.调取上述病人的病理切片,并通过免疫组化检测肝癌组织中的TET2蛋白,并比较两组病人组织切片TET2蛋白的表达高低。3.将si RNATET2转染进肝癌细胞Hep G2以及7721中敲低TET2的表达,获取TET2低表达的细胞株。4用上述转染成功的细胞株来检测其生物学功能。A通过MTT及平板克隆实验测定Hep G2以及7721的增殖能力B通过Transwell实验测定其侵袭和迁移能力C软琼脂实验测定细胞的非锚定能力研究结果1.收集病例并通过SPSS软件分析发现有慢性饮酒史的肝癌病人其血管转移率更高,生存率较低。2.免疫组化发现有慢性饮酒史的病人组织中TET2蛋白含量相对于无慢性饮酒史的患者较低。3.TET2对于肝癌细胞生物学功能的影响A.TET2对细胞增殖能力的影响,平板克隆实验和MTT实验显示:与对照组相对比,敲低TET2后肝癌细胞其增殖能力明显升高,表明TET2的减少促进了肝癌细胞的增殖和克隆形成能力B.TET2对侵袭和迁移能力的影响,Transwell实验显示,与对照组相比,敲低TET2后肝癌细胞的侵袭以及迁移能力明显上升,表明TET2的减少促进了肝癌细胞的侵袭和迁移能力C.TET2对细胞非锚定能力的影响,软琼脂实验表明,与对照组相比实验组其细胞非锚定能力增强,表明TET2的减少增强细胞的非锚定能力。结论1临床病例分析出相对于无慢性饮酒史的肝癌病人,有慢性饮酒史的肝癌病人血管转移率高,5年生存率低。2酒精可刺激肝癌细胞TET2并降低其表达量。3在细胞学实验表明,在肝癌细胞中低表达的TET2可以促进肝癌细胞的生长增殖,侵袭及迁移能力和非锚定能力。