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肿瘤是一个多环节、多因素、多阶段的基因网络疾病。单独靶向一种基因进行治疗，无法达到治愈肿瘤的目的。因此多种基因的联合治疗已经成为肿瘤治疗的一种有效途径。我们已经对EGFR、TERT这两个基因的联合治疗做了初步研究，研究表明两者均是肿瘤治疗的理想靶点。但是前期研究多是采用共转染的方式进行，无法准确的判定两种目的基因是否同时转染进入同一个细胞内，很有可能得到一个假阳性的结果。所以本研究旨在构建一个经过结构修饰的双靶点基因沉默载体，来达到联合基因治疗肿瘤的目的。
本研究构建了一个结构为“启动子-shRNA-shRNA”表达框的RNAi表达载体p-shEGFR-shTERT。对照载体为单基因沉默载体p-shEGFR、p-shTERT。将目的基因沉默载体转染人肝癌细胞SMMC-7721，采用RT-PCR技术检测细胞内EGFR、TERT mRNA的表达;同时利用流式细胞仪检测其对细胞凋亡和细胞周期的影响。
p-shEGFR-shTERT转染SMMC-7721后接种5周龄的雄性裸鼠，每周测量瘤体大小，按照肿瘤体积V=长径×短径2/2计算肿瘤体积，绘制肿瘤生长曲线。饲养4周后，处死裸鼠，剥离肿瘤，称取肿瘤质量。利用PT-PCR技术检测瘤组织内EGFR、TERTmRNA的表达;制作病理切片来观察肿瘤组织的细胞形态。
体外细胞实验结果显示，载体p-shEGFR-shTERT使得细胞内EGFR mRNA表达下降了49.79％，TERT mRNA表达下降了54.88％;流式细胞仪检测结果显示，基因沉默载体都能不同程度的诱导细胞凋亡，其中双基因沉默载体p-shEGFR-shTERT诱导细胞凋亡率为54.71±0.54％，空白对照组细胞凋亡率为17.83±0.82％，p-shEGFR诱导细胞凋亡率为33.97±0.43％，p-shTERT诱导细胞凋亡率为31.91±0.56％，与空白对照组有显著性差异(P＜0.05);周期结果显示p-shEGFR-shTERT将细胞阻滞在G1和G2/M期，载体p-shEGFR将细胞阻滞在G2/M期，载体p-shTERT阻滞在G1期。
裸鼠体内实验结果显示，靶向双基因治疗载体p-shEGFR-shTERT能够有效地抑制肿瘤的生长，对SMMC-7721荷瘤裸鼠的抑瘤率达到了66.43％，瘤体内EGFR mRNA的表达下降了56.3％，TERT mRNA的表达下降了74.1％，具有统计学意义(P＜0.05);p-shEGFR组只有EGFR mRNA表达下降了47.6％，TERTmRNA的表达变化不明显;p-shTERT组只有TERT mRNA表达下降了48.7％，EGFR mRNA的表达变化不明显。瘤组织的石蜡切片HE染色果显示，p-shEGFR-shTERT转染肿瘤细胞后会影响细胞增殖生长，细胞形态发生改变。
p-shEGFR-shTERT可以同时沉默EGFR和TERT基因的表达，可以有效的抑制肝癌细胞SMMC-7721的生长和发生，同时可以引起细胞凋亡，影响细胞周期的分布。双靶点基因沉默技术可以成为肿瘤靶向基因治疗的一种新方法。