论文部分内容阅读
登革病毒(dengue Virus,DV)是黄病毒属的单股正链RNA病毒,大小约为10.6个kb,仅含有一个开放读码框,编码3个结构蛋白(C,prM和E)以及7个非结构蛋白(NS1-NS5)。根据E蛋白抗原性的不同,分为四个血清型(DV1-4)。DV以埃及伊蚊和白纹伊蚊为传播媒介,引起人类的登革热(dengue fever,DF)、登革出血热/登革休克综合征(dengue hemorrhagic fever/dengue shock syndrome,DHF/DSS),每年全世界热带与亚热带地区有2.5亿人受到登革病毒的威胁,其中5千万到一亿人感染DV,DV感染已成为一个严重的公共卫生问题[1-3]。DHF/DSS表现为高热、出血、休克、病死率较高,但其发生机制不明,没有特效的药物和安全有效的疫苗用于防治[4]。血浆渗漏(plasma leakage)是DHF/DSS发生的一个重要特征,也是DV感染后病情恶化的重要指标之一。血浆渗漏往往来势凶猛,表现为血液浓缩,胸腔积液或腹水,但如果补液及时,病人可以在治疗后1-2天恢复,提示血管内皮细胞(vascular endothelial cell,VEC)可能无明显器质性损伤。因此多数学者认为DV感染引起的血浆渗漏可能是由于VEC功能改变或者轻度的内皮细胞结构改变引起的[5-6]。
整合素是广泛分布于细胞表面的跨膜糖蛋白受体,由α和β亚单位组成。作为信号受体,不仅介导细胞与细胞之间、细胞与细胞外基质之间的相互作用,并在细胞的生长、移行、增殖和分化等诸多生理过程中亦发挥重要作用。已知VEC表面分布着丰富的整合素β1和β3。有研究发现,整合素β3对维持毛细血管的完整性,调节血管通透性方面具有重要作用[7-8]。在前期研究中,我们发现DV2进入哺乳动物株ECV304细胞需要整合素β3分子的参与[9-10]。但有研究表明,依据细胞类型的不同,介导DV吸附和进入宿主细胞的蛋白分子有所不同。为此,本实验利用DV2感染血管内皮细胞株EAhy926,检测DV2在该内皮细胞中的增殖规律,以及病毒感染后细胞表面整合素β3的表达变化；在此基础上,进一步将表达DV2各个蛋白的质粒转染EAhy926细胞,分析病毒蛋白与整合素β3表达及共存关系,期望为揭示DV2与整合素β3相互作用的机制提供依据,为深入阐明DV致病机理提供有价值的参考资料。
主要的实验结果如下:
(1)DV2感染上调EAhy926细胞中整合素β3的表达,且病毒抗原与整合素β3有明显共存
首先,我们利用整合素β3的单克隆抗体与DV2的抗体对DV2感染后的EAhy926细胞进行免疫荧光双染色,未感染的EAhy926细胞仅呈现较弱的荧光。而感染组则不同,病毒感染后24h细胞可出现较强的特异性染色,荧光主要分布于细胞膜,随着感染时间的延长,整合素的表达量增加,胞浆也可见特异性荧光,在感染后48hr和72hr,细胞均呈现较强的荧光,提示DV2对细胞的感染可能诱导了整合素β3的表达。经免疫荧光双染色,激光共聚焦显微镜下观察病毒抗原和整合素β3的共存,发现随着病毒感染后整合素β3的表达量逐步增加,病毒抗原与之共存也愈加明显(图3、4、5),24h共存主要分布在包膜,48—72h胞浆内也可见一定量的共存。
同时,采用流式细胞技术,检测DV2感染的EAhy926细胞表面的整合素β3的表达,样品的平均荧光强度代表了整合素的表达量。在整合素β3的检测中,EAhy926感染后24hr,感染组平均荧光强度略高于对照组,随着感染时间的延长,样品的平均荧光强度逐渐增加,在感染后72hr达到峰值,比对照组增加了22％。说明DV2感染增强了整合素β3在EAhy926中的表达。进一步证明DV2感染能够上调整合素β3的表达。整合素β3参与DV2的感染过程,但具体是哪个或哪几个病毒蛋白与整合素β3相互作用,介导病毒进入细胞,尚需进一步实验证明。
(2)DV2 E蛋白上调EAhy926细胞整合素β3的表达,且与整合素β3共存
首先我们构建了表达DV2十个病毒蛋白的真核表达质粒,pRe-C、pRe-prM-E、pRe-NS1-NS2a、pRe-NS2b、pRe-NS3、pRe-NS5,pNS4a-HA、pNS4b-HA和对照质粒pRe HCV-C(表达HCV核心蛋白)、空质粒pReceiverMOl,将上述质粒DNA分别瞬时转染至EAhy926细胞后,间接免疫荧光检测病毒蛋白与整合素β3表达情况。结果显示转染后48h,pRe-prM-E蛋白的表达可诱导整合素β3的表达,整合素β3抗原主要分布在核周和细胞膜上,与E蛋白的表达存在明显共存。除E蛋白外,其它9种DV2蛋白质粒和pHCV-C及空质粒的转染对整合素β3表达无明显影响,也未见其与整合素β3有明显共存,提示整合素β3可能与DV2的E蛋白相互作用参与病毒的感染过程。
同时,我们将pRe-prM-E、pRe-NS1-NS2a、pRe-NS2b、pRe-NS3、pRe-NS5,pReceiverMOl分别通过G418筛选稳定表达株,流式细胞术检测EAhy926细胞表面整合素β3的表达,样品的平均荧光强度代表了整合素的表达量。结果显示,pRe-prM-E、pRe-NS1-NS2a质粒转染EAhy926细胞后整合素β3的表达相比较空载体转染组不但没有升高反而降低,可能与E蛋白的膜融合特性有关。
综合上述结果,DV2感染可以诱导整合素β3高水平的表达,整合素β3的表达上调可能有助于病毒进入宿主细胞。本实验的结果为揭示整合素β3在DV感染的病理过程中的作用提供了重要的理论基础。对于整合素β3与E蛋白的结合位点以及DV2感染上调整合素β3的分子机制还有待进一步研究。