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目的本实验通过2种青光眼动物模型:N-甲基-D-天门冬氨酸(NMDA)诱导的C57小鼠和SD大鼠的视网膜兴奋性毒性模型和自发性青光眼DBA小鼠,来探究α-黑素细胞刺激素(α-MSH)对青光眼模型中的视网膜损伤的保护作用,并通过RNA甲基化免疫沉淀测序(Me RIP-seq)探寻α-MSH对视网膜损伤的保护机制。方法C57小鼠随机分为正常对照组、2 m M NMDA组、10 m M NMDA组、20 m M NMDA组和40 m M NMDA组。SD大鼠随机分为正常对照组、NMDA低剂量组(0.05μM、0.1μM、0.15μM和0.2μM NMDA)和NMDA高剂量组(16.7 m M、33.3 m M、50 m M和66.7 m M NMDA)。注射一周后,C57小鼠和SD大鼠均行光学相干断层扫描仪(OCT)照相、苏木素-伊红(H&E)染色和视网膜铺片。另,确定SD大鼠注射NMDA的合适浓度后,将SD大鼠分为3组:正常对照组、NMDA组和NMDA+α-MSH组。一周后,SD大鼠行H&E染色、视网膜铺片和闪光视觉诱发电位(F-VEP)。此外,收集SD大鼠的视网膜进行m RNA的m5C甲基化检测。DBA雌性小鼠每周均行裂隙灯照相和眼压测量。当DBA小鼠眼压稳定大于15 mm Hg时,一半小鼠的玻璃体腔中注入生理盐水,另一半小鼠玻璃体腔中注入α-MSH。之后,所有DBA小鼠行裂隙灯照相、眼压测量、H&E染色和视网膜铺片。结果不同浓度NMDA处理C57雄性小鼠的视网膜总厚度明显小于正常对照组(均为P<0.01)。H&E染色显示,NDMA处理的视网膜神经节细胞层(GCL)的细胞数均明显低于正常对照组(均为P<0.01)。此外,视网膜铺片染色显示,玻璃体腔内注射不同浓度的NMDA均可减少视网膜中β3-Tubulin阳性细胞的数量(均为P<0.001)。在SD大鼠模型中,正常对照组与一些NMDA低剂量组之间GCL细胞数有显著性差异,包括0.05、0.15和0.2μM NMDA组(均为P<0.01)。此外,与正常对照组相比,大剂量NMDA对大鼠视网膜GCL细胞有明显的损伤作用(均为P<0.001)。特别是,50 m M NMDA将GCL细胞数减少到正常对照的一半。视网膜神经细胞的急剧减少导致视神经功能异常,F-VEP测量显示了29.57%的潜伏期延长和79.61%的振幅降低。然而,通过玻璃体内注射α-MSH可改善或纠正这些异常。Me RIP-seq结果显示,与NMDA组相比,NMDA+α-MSH组共鉴定出1946个m5C差异性甲基化m RNA,其中1591个显著上调,355个显著下调。GO分析显示差异性甲基化m RNA影响了神经系统调节和细胞钙离子稳态等生物学过程。KEGG分析显示,m5C差异性甲基化m RNA在Hedgehog信号通路、腺苷-3’,5’-环化一磷酸(c AMP)信号通路和钙信号通路中富集。C57对照组小鼠的眼前节情况在不同周龄基本无差异,IOP也一直维持在10mm Hg左右。然而,DBA小鼠自5月龄(约20w)后逐渐出现虹膜萎缩、虹膜色素分散和虹膜光透射;眼压(IOP)自28周开始升高,一周后达到15 mm Hg。不同周龄DBA小鼠的IOP差异有统计学意义(F=2.450,P=0.010)。更重要的是,与注射生理盐水的DBA小鼠和α-MSH处理的DBA小鼠的IOP整体相比,差异统计学意义(t=3.479,P=0.001)。H&E染色显示DBA组视网膜GCL细胞数显著减少,仅为C57组的52.29%(P<0.001),而α-MSH玻璃体腔内给药可将GCL细胞数显著增加至正常对照组的79.32%(P<0.001,DBA组vs DBA+α-MSH组;P>0.05,正常对照组vs DBA+α-MSH组)。视网膜铺片结果表明,与DBA组相比,DBA+α-MSH组β3-Tubulin阳性细胞数量显著增加。结论玻璃体腔内注射NMDA剂量依赖性地降低了雄性C57小鼠和SD大鼠的视网膜总厚度、GCL内细胞数,以及视网膜中β3-Tubulin阳性的细胞数量。而α-MSH可对玻腔注射50m M NMDA诱导的大鼠RGCs死亡、视网膜形态和视神经功能损伤有保护作用。机制方面,α-MSH可能通过调控Hedgehog信号通路、c AMP信号通路和钙信号通路中m RNA的m5C甲基化而发挥保护作用。DBA雌性小鼠,相比于野生型小鼠,眼压从28周开始逐渐升高,至30周达到峰值并维持稳定。同时,DBA小鼠虹膜出现播散、光透射和萎缩等表型。玻腔注射α-MSH可改善自发性青光眼DBA小鼠模型的IOP并显著减少RGCs丢失。