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胆固醇酰基转移酶(ACAT)是细胞内唯一催化游离胆固醇和长链脂肪酸形成胆固醇酯的酶，在维持细胞胆固醇动态平衡中起极重要的功能作用。在哺乳动物中，已经鉴定出了两种ACAT基因分别编码ACAT1和ACAT2，其中ACAT1在所有已检测的细胞中均表达，而ACAT2只在肝、肠细胞中特异性表达。我们实验室与美国TY Chang实验室合作的前期研究表明，人单核类细胞ACAT2基因启动子含有特征性CpG低甲基化谱式、且ACAT2基因处于低水平表达和由转录因子C/EBPs通过结合启动子低甲基化区段的相应顺式元件而调控该低水平表达;人ACAT1 cDNAK1对应的4011-bp mRNA来源于1号和7号两条染色体，此一跨染色体反式剪接产生的4011-bp mRNA可与重组质粒来源转录本asAmp发生进一步的反式剪接，致使细胞产生56-kD和50-kD两种活性不同的ACAT1异构体酶。在这些研究的基础上，我的论文工作主要有两部分，分别是对白细胞ACAT2低水平表达及其依赖的脂蛋白分泌功能、人细胞ACAT1mRNA的跨染色体反式剪接与降解调控进行探索研究。 第一章 白细胞ACAT2低水平表达及其依赖的脂蛋白分泌功能 我们已有的工作发现，人单核类细胞ACAT2基因启动子含有特征性CpG低甲基化谱式，且ACAT2基因处于低水平表达和由转录因子C/EBPs结合基因启动子区低甲基化区段的相应顺式元件而调控ACAT2低水平表达。在这些基础上，我的第一章工作，首先分离人血中的各类白细胞继续深入研究，结果显示所有的人血白细胞中ACAT2低水平表达及其与转录因子C/EBPs mRNAs表达、启动子特征性CpG低甲基化谱式具有对应性关系。进而，利用人白细胞株研究发现，有4株人白细胞ACAT2低水平表达及其与转录因子C/EBPs表达、启动子特征性CpG低甲基化谱式具有对应性关系、而且均显示有明显的脂蛋白分泌。深入的实验结果揭示，ACAT2异构体选择性抑制剂PPPA剂量依赖性抑制人白细胞株的脂蛋白分泌，呈现剂量参数IC50。更有意义的是，促分化因子ATRA可显著提高人白细胞株ACAT2低水平表达依赖的脂蛋白分泌功能，但致炎因子TNFα则无此效应;且在应用人血白细胞实验中获得一致结果而证实。这些表明，人白细胞ACAT2低水平表达及其在依赖性脂蛋白分泌中发挥重要功能作用。 在以上研究基础上，深入对小鼠和大鼠血白细胞的ACAT2表达研究发现，小鼠血白细胞ACAT2基因的启动子特征性CpG低甲基化谱式、转录因子C/EBPs表达、ACAT2低水平表达及其依赖的脂蛋白分泌等，均与人血白细胞相近。然而，由于ACAT2基因启动子区高甲基化及仅有C/EBPβ基因等，大鼠血白细胞未有ACAT2表达、也检测不到相应的脂蛋白分泌。特别重要的是，直接用小鼠全血替代分离白细胞，同样可准确测定选择性抑制剂PPPA抑制ACAT2低水平表达依赖的脂蛋白分泌功能;且通过ACAT异构体特异性敲除小鼠和ACAT1异构体选择性抑制剂等实验结果，进一步肯定直接应用小鼠与人全血均可准确测定ACAT2低水平表达依赖的脂蛋白分泌功能。这些研究工作，为深入创建血液白细胞ACAT2活性功能的快速检测临床系统、为研发ACAT异构体选择性抑制剂相关新药提供适宜动物模型等奠定了厚实基础。 第二章 人细胞ACAT1 mRNA跨染色体反式剪接与降解调控 我们已有的研究表明，人ACAT1 cDNA K1对应的4011-bp mRNA来源于1号和7号两条染色体，此一跨染色体反式剪接产生的4011-bp mRNA可与重组质粒来源转录本asAmp发生进一步的反式剪接，致使细胞产生56-kD和50-kD两种活性不同的ACAT1异构体酶;来自7号染色体的long non-coding RNA(lncRNA) ACAT1C7与1号染色体ACAT1 mRNA发生跨染色体反式剪接引起产物RNA快速decay。在此基础上，我的论文工作着重探索人细胞ACAT1 mRNA跨染色体反式剪接与降解调控。针对跨染色体反式剪接及其引起ACAT1 mRNA快速decay机制研究的难题，一是探索发现通过降低细胞RNA特异降解酶Dom3z/Xrn2可显著提高跨染色体反式剪接产物RNA（即抑制了RNA decay）;二是研究发现利用HeLa细胞合成过量胆固醇可促进ACAT1 mRNA decay和上调56-kD ACAT1异构体（即提高了跨染色体反式剪接）而建立了跨染色体反式剪接的胆固醇合成调控系统，同时分析检测到人神经细胞株分化为神经元、人血单核细胞体外培养分化为巨噬细胞过程同样上调56-kD ACAT1异构体;三是研究利用人单核细胞株THP-1培养分化并形成泡沫细胞过程上调56-kD ACAT1异构体等的实验条件，试进行高通量测序鉴定人ACAT1 mRNA跨染色体反式剪接中间体序列。这些优化提高跨染色体反式剪接产物分析测定系统的探索研究，为阐析人ACAT1 mRNA的跨染色体反式剪接与降解调控机制等提供了极重要基础。 综上所述，在这两部分工作中，发现人和小鼠血液白细胞ACAT2低水平表达及其依赖的脂蛋白分泌功能，并建立应用其全血进行准确测定ACAT2低水平表达依赖的脂蛋白分泌功能的系统方法，这些为深入创建血液白细胞ACAT2活性功能的快速检测临床系统、为研发ACAT异构体选择性抑制剂相关新药提供适宜动物模型等奠定了厚实基础;优化提高人ACAT1 mRNA跨染色体反式剪接产物分析测定系统，包括跨染色体反式剪接RNA decay系统、胆固醇合成调控系统和高通量测序鉴定中间体序列系统，为进一步阐析极难的跨染色体反式剪接调控ACAT1活性机制不断完善策略。这些研究表明，不论是ACAT1还是ACAT2在不同组织中的表达都受到精细调控，对细胞生命和细胞活动发挥不可或缺的功能作用。