论文部分内容阅读
目的：我们的前期研究发现：活动期SLE患者外周血中CD4~+T细胞穿孔素mRNA的表达和蛋白的含量明显的增高，同时也发现CD4~+T细胞穿孔素基因启动子区域出现了低甲基化。进而用DNA甲基化抑制剂5-杂氮胞苷(5-azaC)处理正常CD4~+和CD8~+T细胞后，穿孔素的表达都有显著的增高，这种增高与CD4~+和CD8~+T细胞穿孔素基因启动子区域出现的低甲基化有关。那么DNA高甲基化是否会使穿孔素表达下调呢?本实验拟克隆穿孔素基因启动子区域(PRF1)，并对PRF1进行体外区域性高甲基化，为探讨穿孔素基因调控序列高甲基化能否引起穿孔素表达下调奠定基础。方法：(1)以人全基因组DNA为模板，通过PCR扩增方法获得穿孔素基因启动子区域(PRF1)。(2)将PRF1克隆到T载体，双酶切鉴定并测序证实；再定向亚克隆至报告基因载体pGL3-Basic中。(3)大量酶切得到目的片断，用甲基化酶M．SssI及甲基供体S-腺苷甲硫氨酸(SAM)对PRF1片段进行体外区域性高甲基化，再将高甲基化的目的基因片段重新连接至pGL3-Basic。结果：(1)成功克隆PRF1到T载体和报告基因载体pGL3-Basic且得到双酶切及测序结果证实。(2)对PRF1片段进行体外区域性高甲基化后鉴定显示PRF1片段区域性高甲基化完全。结论：成功克隆PRF1到报告基因载体pGL3-Basic并对PRF1片段进行体外区域性高甲基化，为后续实验奠定了基础。