论文部分内容阅读
稻瘟病是水稻最严重的病害之一,利用宿主抗性进行品种的抗病遗传改良为稻瘟病提供了经济有效和环境友好的解决办法。但稻瘟病病菌的群体变异频繁,导致水稻单个抗性基因品种的抗病效果在短时间内减弱甚至丧失。因此,需要进一步的研究稻瘟病抗性机制,开发新的广谱抗性基因,为水稻抗性育种提供新的资源。本研究中的稻瘟病抗性基因Pi63具有良好的田间抗性,前期实验结果表明Pi63的表达量在抗性品种中很高,且抗性与其表达量成正相关,推测这一特性与启动子的调节和表达模式密切相关。前期研究利用生物信息学软件分析了Pi63启动子区域的顺式作用元件,根据预测的顺式作用元件的分布位置不同,分段构建了4个启动子缺失片段。本研究并将上述构建体分别连接GUS基因和Pi63全长基因进行遗传转化分析其启动子的表达特性及对抗病的影响。此外,Pi63位于水稻4号染色体31 Mb区域内,是这个区域内被克隆的第一个基因。为研究Pi63的进化机制,发掘抗性资源,本研究在收集的栽培稻和野生稻品种里克隆了Pi63的同源基因,并对同源基因的转基因植株进行了抗病分析。本研究取得的结果如下:⑴将上述缺失体连接Pi63全长基因转入植物双元表达载体pMDC99（分别命名为pMDC99-P0fl到P3fl）中,完成了水稻品种日本晴的遗传转化。利用实时荧光定量PCR的方法检测了转基因T1代阳性植株的拷贝数,将筛选出单拷贝植株活体接种稻瘟病菌种007,并检测接种前后Pi63基因的表达量。结果表明,与接种前相比,接种后P1fl的表达量最高,P0f1其次,P2f1和P3f1变化不大,推测与抗病响应相关的顺式作用元件处于P1与P2中间的区域,P0到P1的区域存在负调控或者回馈调控元件。同时,构建了与上述位置相同的4个启动子片段连接GUS基因的表达载体（分别命名为pCAMBIA1391Z-P0到P3）并进行水稻日本晴品种的遗传转化。T1代阳性植株的GUS染色和GUS酶活检测表明,pCAMBIA1391Z-P0、pCAMBIA1391Z-P1、pCAMBIA1391Z-P3在日本晴的根、茎、叶均有表达,在叶中表达最强。其中pCAMBIA1391Z-P1的GUS染色颜色最深,GUS酶活力最强,推测P0区域存在负调控元件,这与上述表达量结果基本一致。⑵成功从Owarihatamochi、Morobereban、以及不同来源的3个普通野生稻材料中分别扩增得到Pi63的同源基因O3、M4、Hg3、Hg5、Hg7。将上述五个同源基因连接Pi63启动子转入植物双元载体pMDC99,进行了日本晴的遗传转化。对T0代阳性植株进行离体接种稻瘟病菌种007,结果表明Hg5对该生理小种具有一定抗性,其他基因的抗性有待于进一步的鉴定。