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目的:ALI/ARDS的发病机制错综复杂,迄今尚未完全阐明,早期诊断ALI/ARDS也是目前临床研究重点。通过建立内毒素诱导的新生大鼠急性肺损伤(ALI)模型,用Western dot blot(免疫印迹法),测肺组织水通道蛋白5浓度,探讨AQP5在ALI发病机制中的作用,取血及肺灌洗液检测Clara细胞蛋白(CC16)并观察其动态变化,探讨CC16在急性肺损伤早期诊断中的意义。
方法：将140只新生SD大鼠分两批(每批70只)给予LPS 5mg/kg腹腔注射制作新生大鼠ALI模型。70只新生SD大鼠随机分为对照组和模型组,对照组8只大鼠仅给予生理盐水腹腔注射；模型组根据LPS注射后处死时间分为：模型0.5h组、1h组、2h组、4h组、8h组、16h组和24h组7个亚组；模型0.5h组、1h组、2h组、4h组和8h组,各组8只新生SD大鼠；16h组10只,其中死亡1只,24h组10只,其中死亡4只。于注射后各时间点断头取血,离心后取血清置于-20℃冰箱冻存,待测定CC16含量。并立即打开胸腹腔,肉眼观察肺组织大体病理改变；取肺组织标本制作HE染色切片,在光镜下观察肺组织病理学变化；取肺叶称湿重(W)后,置70℃恒温箱,24h后再称干重(D),计算W/D比值；取肺组织匀浆后用Western dot blot(免疫印迹法)测水通道蛋白5浓度。另取70只新生SD大鼠按以上分组(分为对照组和模型组)收集支气管肺泡灌沈液(BALF),-80℃保存,用以检测CC16含量。
结果：
1.大鼠肺组织肉眼观察对照组肺组织外观两肺大小适中,淡粉肉色,外表光滑柔和,弹性较好；模型组在腹腔注射LPS后,各亚组均有不同程度的充血、水肿。其中0.5h组可见针尖样肺出血；8h组出血程度由局灶性到弥漫性逐渐加重；16h组、24h组部分大鼠死亡,继续存活者,肺组织大体改变较8h未见明显加重。
2.光镜改变模型组在腹腔注射LPS 1h后可见肺泡壁增厚,肺间质水肿,肺泡腔变窄,泡壁毛细血管充血；2h后间质和肺泡腔可见红细胞逐渐增多,4h后病变更明显,可见中性粒细胞浸润。
3.肺组织W/D比值模型组新生大鼠肺组织W/D比值在0.5h即开始升高,1～2h迅速上升,2h时达到高峰,之后开始回落,16～24h接近正常肺组织W/D比值；模型2h组与对照组比较,模型组明显高于对照组(P<0.01),4h组与对照组有差异(P<0.05),16h及24h组基本接近生理盐水对照组,无统计学意义。
4.水通道蛋白5模型0.5h组大鼠肺组织AQP5表达开始下调,LPS刺激后1～2h组达到最低,随后AQP5表达开始逐步升高,8h组AQP5表达接近正常水平,8h后又出现一定水平的下调直至24h。
5.肺干/湿重比值与AQP5的相关关系模型组肺干/湿重比值与AQP5呈负相关关系,即AQP5下调,肺干/湿重比值上升。
6.血清及支气管肺泡灌洗液CCl6 LPS致伤后大鼠BALF中CC16水平迅速下降,模型组各组均较对照组有显著性差异(P<0.01);模型组血清CC16水平较对照组上升,从注射LPS 2h后开始有差异,4h达高峰,以后呈下降趋势,但8h、16h组仍明显高于对照组(P<0.01)。
结论：
1.内毒素(LPS)腹腔注射新生大鼠可成功制备新生大鼠急性肺损伤(ALI)动物模型。
2.新生大鼠发生ALI时,早期即出现明显的AQP5表达下调,并与肺组织干/湿重比值呈负相关关系,表明肺损伤后AQP5表达下调与肺泡上皮液体转运功能降低有关,在调节肺内液体平衡中起一定作用,可能是导致肺泡水肿形成的重要因素之一。
3.在新生大鼠ALI早期,BALFF中CC16即下降,血清CC16上升,反映了Clara细胞损伤,以及肺泡-毛细血管膜完整性损伤,两者可作为早期反映ALI的敏感的实验室指标。