论文部分内容阅读
目的探索左旋多巴（L-DOPA）诱导马尔尼菲青霉（Penicilliummarneffei, PM）酵母相合成黑素的影响因素，研究黑素化后的PM对常见抗真菌药物的敏感性是否改变以及PM黑素的抗原性。方法将PM临床人分离株GXMU121011接种于沙氏培养平皿（SDA）中37℃培养7天，观察不同L-DOPA浓度（0.1mM，1mM，3mM，6mM，10mM）和不同PM菌接种密度（105CFU/ml，106CFU/ml，107CFU/ml）对PM黑素合成的影响；使用纸片法进行体外抗真菌药敏试验，分别测定伊曲康唑、氟康唑和两性霉素B对8株PM菌株在添加L-DOPA和无L-DOPA培养时的抑菌圈大小；利用PM黑素作为抗原经腹腔免疫BALB/c小鼠，在PEG介导下小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞进行融合反应制备单克隆抗体，通过凝集试验和ELISA法检测免疫小鼠血清和所制备PM黑素抗体的效价，免疫荧光法检测免疫小鼠血清中抗体与黑素化培养PM酵母相细胞结合情况；此外，采集PM感染患者血清，通过凝集试验检测血清中的抗体与PM黑素颗粒凝集反应情况。结果（1）①PM受试菌株在含不同多巴浓度的SDA平皿中37℃培养7天后，含L-DOPA的菌落或菌落周围培养基颜色均有不同程度的加深或变黑，而不含L-DOPA的则未见明显改变；②L-DOPA浓度由0.1mM增加至1mM时，PM菌落变黑程度随之增加；L-DOPA浓度处在1mM、3mM时菌落颜色最黑，菌落变黑程度随着浓度的递增逐渐降低；L-DOPA浓度在10mM时菌落出现形态皱缩。（2）不同接种密度的PM菌悬液在含1mM L-DOPA的SDA平皿中37℃培养7天后，菌落颜色变黑程度不一，菌落颜色随着菌密度的逐渐升高而加深。（3）8株PM菌株在含L-DOPA和不含L-DOPA（对照组）的SDA培养，48~96h测量抑菌圈大小。测得伊曲康唑、两性霉素B和氟康唑对PM抑菌圈平均直径依次为：伊曲康唑，26.88±1.81mm（对照组，34.13±1.81mm）；两性霉素B，17.13±2.59mm（对照组，22.25±4.80mm）；氟康唑，19.50±6.46mm（对照组，25.87±7.34mm）；含L-DOPA和不含L-DOPA培养两组比较均有显著性差异（P<0.05）。（4）①PM黑素腹腔免疫接种小鼠4周后，小鼠均出现不同程度腹水和脱毛；②PM黑素免疫小鼠的腹水、血清和融合杂交瘤细胞培养上清液均与PM黑素颗粒和人工合成DOPA黑素产生凝集反应，ELISA法检测示免疫小鼠的腹水、血清和融合杂交瘤细胞培养上清液中抗体OD值依次为1.635±0.085、1.820±0.249、0.671±0.142。免疫荧光法显示当加入免疫小鼠血清，L-DOPA培养的PM酵母相细胞壁出现绿色荧光。PM感染患者血清与PM黑素颗粒出现凝集反应。结论（1）L-DOPA的浓度和接种菌落的密度影响PM黑素的生成。（2）以L-DOPA作为底物黑素化培养酵母相PM，其对抗真菌药物伊曲康唑、两性霉素B和氟康唑的敏感性下降。（3）PM黑素颗粒可以刺激机体产生抗体。