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本研究完成了对商城肥鲵的二碱基和四碱基重复类型微卫星位点的分离和筛选工作。对筛选过程中得到的微卫星序列进行分析后发现在商城肥鲵中微卫星的结构特征对筛选效率产生了较为明显的影响。利用筛选得到的微卫星位点对商城肥鲵16个采样点共296个个体进行种群遗传学研究。这些实验得到以下研究结果。
(一)通过FIASCO途径对商城肥鲵进行二碱基(AC/AG)和四碱基(ATAG)重复类型微卫星位点的分离和筛选。经过酶切连接、探针杂交、磁珠洗脱、恢复双链、质粒连接、克隆测序、引物设计和扩增条件摸索、基因分型和数据分析等步骤后,得到3个二碱基重复微卫星位点和14个四碱基重复微卫星位点。这些位点的等位基因数从4到19,期望杂合度Ho从0.267到0.912,观测杂合度He从0.412到0.950。
(二)商城肥鲵二碱基重复、四碱基重复微卫星DNA的结构特征及对筛选效率的影响。在对微卫星筛选实验结果进行分析后,发现在商城肥鲵中二碱基微卫星位点多以微卫星DNA家族形式存在,并因此导致了微卫星位点分离较低的筛选率;在四碱基重复的微卫星位点中未发现微卫星DNA家族的存在。对研究中得到的3个微卫星DNA家族的分析发现同一家族的上、下游侧翼序列变异程度存在差异;毗邻微卫星重复单元区的侧翼序列碱基变异程度较高,而较远处的区段则相对保守,这些结构特征可能反映出微卫星DNA家族在演化中的复杂性。研究结果提示在两栖动物的一些类群中,微卫星的筛选必须考虑微卫星DNA家族的影响,选取适宜的碱基重复类型将是决定筛选效率的关键所在。
(三)使用12个微卫星位点对商城肥鲵16个采样点共296个个体进行种群遗传学研究。16个采样点的期望杂合度(He)从0.566到0.822,观测杂合度(Ho)从0.526到0.789,分别对应着采样点金寨县九峰尖林场(Jfj)和岳西县包家小石屋冲(Xswc)。金寨县金刚台林场(Jgt)、金寨县九峰尖林场(Jfj)、金寨县窝川林场(Wo)、岳西县包家小石屋冲(Xswc)、岳西县鹞落坪多枝尖(Duo)和英山县黄柏山(Hbs)种群明显偏离哈温平衡。12个微卫星位点的等位基因分布情况各不相同,其中Psh74、Psh493、Psh146和Psh118呈现出典型的单峰分布。
大部分种群间的Fst值均在统计上均得到显著支持(P<0.05)。其中金寨县九峰尖林场(Jfj)和霍山县白马尖金竹坪(Bmj)种群之间的遗传差异最大(Fst=0.196),霍山县白马尖金竹坪(Bmj)和金寨县汤汇镇焦园(Jy)种群间的遗传差异最小(Fst=0.011)。
根据相关因子分析得到的遗传差异模式表现为金寨县金刚台林场(Jgt)、金寨县汤汇镇焦园(Jy)、金寨县九峰尖林场(Jfj)和金寨县康王寨林场(Kwz)种群与其他各种群明显分离,各自之间也较为分散的分布于图的左边。金寨县马鬃岭林场(Mzl)、金寨县窝川林场(Wo)、金寨县天堂寨黄氏河(Tth)、金寨县天堂寨风景区(Ttz)、霍山县白马尖金竹坪(Bmj)、岳西县大川岭(Da)、岳西县包家小石屋冲(Xswc)、岳西县包家乡耳棚沟(Epg)、岳西县鹞落坪多枝尖(Duo)、英山县黄柏山(Hbs)、英山县八里排(Blp)和岳西县明堂山(Mts)种群重叠分布于一个小的范围内,明显聚为一群,位于图的右边。
NJ系统进化树结果显示12个种群被分为3枝。第1枝由岳西县鹞落坪多枝尖(Duo)和英山县黄柏山(Hbs)组成;第2枝包括了除岳西县包家小石屋冲(Xswc)外的种群,其中金寨县金刚台林场(Jgt)、金寨县汤汇镇焦园(Jy)、金寨县九峰尖林场(Jfj)和金寨县康王寨林场(Kwz)种群又与其他种群遗传差异较大,在独立的一个小分枝内;第3枝为岳西县包家小石屋冲(Xswc)种群。
使用Structure做遗传聚类分析结果显示12个采样点被分为两个大的种群。金寨县金刚台林场(Jgt)、金寨县汤汇镇焦园(Jy)、金寨县九峰尖林场(Jfj)和金寨县康王寨林场(Kwz)种群明显在一个遗传聚类,其余种群在第二个遗传聚类。
瓶颈效应分析结果不支持两个大的种群近期经历瓶颈的假设。