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PKR是脊椎动物抗病毒免疫反应的主要功能蛋白,它可以在病毒感染和其它多种胁迫刺激下,通过介导细胞信号转导引起细胞抗病毒免疫反应,并且通过抑制细胞蛋白合成导致细胞凋亡。PKR属于Ser/Thr蛋白激酶家族,又属于ds RNA结合蛋白家族。其分子结构包括N端的ds RNA结合结构域(ds RBD)和C端的激酶活性结构域(Kinase Domian,KD)。其中ds RBD对KD的激酶活性起着调节作用。PKR的ds RBD一般由2个(哺乳动物)或3个(少数鱼类)ds RNA结合模体(ds RBM)构成。多重序列比对和系统进化分析显示,少数含有3个ds RBM的鱼类PKR的ds RBM在结构上具有很大的相似性,但在进化上却有不同的来源。本研究对本实验室克隆的草鱼(Ctenopharyngodon idella)PKR(Ci PKR)所含有的3个ds RBM进行了分析和鉴定。Ci PKR的ds RBM具有典型的ds RBM的结构特点,并含有的与其ds RNA结合功能密切相关的保守氨基酸区域。在Ci PKR的3个ds RBM里面,ds RBM1仅在少数鱼类PKR中发现;而ds RBM2和ds RBM3在进化上分别与哺乳动物PKR的ds RBM1和ds RBM2相近。原核表达单独的ds RBM蛋白的二聚化实验显示:Ci PKR的ds RBM1和ds RBM2不仅能进行同二聚化,还能进行同多聚化;但是,ds RBM3就像哺乳动物ds RBM2一样,只能进行同二聚化,不能进行同多聚化;同时,原核表达含2个或3个ds RBM的ds RBM1-2,ds RBM2-3和ds RBM1-2-3蛋白也是既能进行同二聚化,又能进行同多聚化。Poly I:C对原核表达各ds RBM蛋白的pull-down实验显示:单独一个ds RBM并不能明显地与Poly I:C结合;而含有2个或3个ds RBM的蛋白则能明显地与Poly I:C结合。为了进一步研究ds RBM对Ci PKR激酶活性的影响,本研究设计构建了一系列含有不同种类和不同数量的Ci PKR突变体,包括Ci PKR-Δds RBM2-3、Ci PKR-Δds RBM1,3、Ci PKR-Δds RBM1-2、Ci PKR-Δds RBM3、Ci PKR-Δds RBM1。并将这些重组质粒和带有启动子和荧光素酶基因的质粒PGL3共转染到草鱼肾(CIK)细胞,然后分析它们对CIK细胞内荧光素酶蛋白翻译抑制的差异。结果显示,与转空载pc DNA3.1质粒的CIK细胞相比,转Ci PKR-wt、Ci PKR-Δds RBM2-3、Ci PKR-Δds RBM1,3、Ci PKR-Δds RBM1-2、Ci PKR-Δds RBM3和Ci PKR-Δds RBM1质粒的细胞荧光素酶蛋白翻译分别被抑制了78.7%、15%、0、0.5%,、61.8%、67.3%。因此,含有1个ds RBM的Ci PKR突变体对CIK细胞合成荧光素酶蛋白的抑制作用极小;含有2个ds RBM的Ci PKR突变体具有较强的抑制作用;而Ci PKR-wt则具有最强的抑制作用。同样,通过MTT和CCK-8实验检测CIK细胞在分别转染以上各质粒后的细胞活力,发现与空白对比,在转染后24 h它们的细胞活力变化很小;在转染后48 h,含有单个ds RBM的Ci PKR突变体几乎不具有抑制细胞活力的作用;含有2个ds RBM的Ci PKR具有较强的抑制细胞活力的作用;而Ci PKR-wt具有最强的抑制活力作用。进一步的细胞计数实验也证实,转染Ci PKR-wt和Ci PKR-Δds RBM3,Ci PKR-Δds RBM1重组质粒具有较强的降低细胞数量的作用。因此,Ci PKR的N端串联排列2个ds RBM对其抑制蛋白翻译功能是必需的。Ci PKR的N端多含有1个ds RBM1增强了它抑制蛋白合成的功能。为了进一步研究Ci PKR在抗病毒免疫反应中抑制蛋白翻译作用和细胞抗病毒免疫细胞因子合成的关系。本研究进一步克隆了Ci PKR抑制蛋白翻译作用的主要靶蛋白,真核细胞翻译起始因子2α(e IF2α)。首次发现草鱼存在2个e IF2α,分别是Cie IF2α(Accession number:KJ126860.1,GI:597914306)和Cie IF2α-like(Accession number:KJ126861.1,GI:597914308)。本研究还克隆了细胞抗病毒免疫反应中,可能存在绕过Ci PKR对细胞蛋白合成抑制作用,与抗病毒细胞免疫因子蛋白翻译有关基因Cie IF2A(Accession number:KJ126862.1,GI:597914310)。半定量和转录表达分析显示,在抗草鱼出血病毒(GCHV)的抗病毒免疫反应中,Cie IF2α的转录表达在24 h内降低,而Cie IF2A的转录表达上调。其转录表达模式的差异说明两者在CIK细胞抗病毒免疫反应中的蛋白合成可能起着不同的作用,并且说明在CIK细胞内可能存在绕过一种Ci PKR的机制,即依赖于Cie IF2A或Cie IF2α-like的蛋白翻译途径。对Ci PKR、Cie IF2α和Cie IF2α-like进行了原核表达,并用以免疫大白兔制备多克隆抗体。通过ELISA和WB实验检测,证明制备的多克隆抗体是有效的。通过设计合成Ci PKR特异的si RNA,在GCHV刺激CIK细胞后对Ci PKR进行knockdown,然后用Q-PCR和WB的方法分析CIK细胞Ci PKR和Ci IFN的表达。结果发现,Ci PKR特异的si RNA,能有效降低Ci PKR的m RNA和蛋白表达水平,但Ci IFN的m RNA和蛋白表达水平却发生了上调。用PKR的抑制剂2-AP作用于GCHV刺激后的CIK细胞,Ci IFN的转录表达也有一定的上调。说明CIK细胞在Ci PKR敲降或Ci PKR活性被抑制后,Ci IFN的表达可能经由绕过PKR/NF-κB的表达途径。用TLR受体的抑制剂CQ作用于GCHV刺激后的CIK细胞,Ci PKR和Ci IFN的表达不仅没有上调,还有一定的下降。说明GCHV刺激CIK细胞引起Ci PKR和Ci IFN的表达上调经过了TLR的信号转导作用。