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背景和目的:骨性关节炎(Osteoarthritis,OA)是目前老年人群中常见的退行性骨关节疾病。OA患者的主要临床表现为关节疼痛、活动受限,并伴有关节僵硬、肿胀等症状,严重影响患者的生活质量。由于OA的病因和发病机制未明,缺乏有效的治疗药物,因而大多数OA患者最终需接受人工关节置换术才能缓解症状。有鉴于此,深入分析致病因素和发病机理,寻找治疗靶点,从而对OA进行早期干预治疗是当前的研究热点。近年来,随着研究的深入发现,代谢综合征(Metabolic Syndrome,MetS)尤其是二型糖尿病(Type 2 Diabetes Mellitus,T2DM)能够促进OA的发生发展。OA的病理变化不仅包括关节软骨受损,还涉及滑膜、关节囊等多种关节软组织的病变。大量研究表明,滑膜炎症不仅出现在OA的初始阶段,而且在OA的整个疾病进展过程中发挥重要作用。滑膜细胞的异常增殖活化以及滑膜分泌的多种致炎因子与关节软骨病变和患者临床症状(关节疼痛、肿胀等)均密切相关,因此,滑膜炎症可作为治疗OA的新靶点。高胰岛素血症(Hyperinsulinemia,HINS)作为MetS及T2DM共同的发病基础,其在OA病变中的作用仍有待研讨,因而本研究采用胰岛素刺激人类膝关节原代成纤维样滑膜细胞(Fibroblast-Like Synoviocytes,FLSs),观察其是否促进滑膜炎性反应,并探究其可能的调控机制。材料和方法:1.在三个时间段(6、12和24小时)内采用不同浓度(0、100、200、500nmol/L)的胰岛素刺激FLSs后,分别采用CCK-8法和Transwell法检测其增殖活性和趋化巨噬细胞能力的变化,采用实时荧光定量 PCR(Reverse Transcription-Quantitative Polymerase Chain Reaction,RT-qPCR)技术和酶联免疫吸附实验(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay,ELISA)分别检测其促炎介质如白细胞介素(interleukin,IL)-1β、IL-6、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)-α、基质金属蛋白酶(matrixmetalloprotein,MMP)-9、MMP-13在基因表达水平和细胞分泌水平以及趋化因子如CXCL12、CCL2/MCP-1和CCL5/RANTES细胞分泌量的变化。2.免疫印迹试验(Western Blot,WB)检测 PI3K/Akt、mTOR 和 NF-KB 三种信号通路在FLSs内的激活情况;免疫荧光试验(Immunofluorescence,IF)验证NF-KB信号亚基蛋白的细胞定位。分别阻断三种信号通路之后,观察其对胰岛素刺激下FLSs的增值活性和促炎介质及趋化因子变化情况的影响。3.采用胰岛素单独刺激FLSs或使用抑制剂预先阻断其信号通路后,RT-qPCR技术检测IL-1β、IL-6和TNF-α的常见细胞受体:白细胞介素-1受体(interleukin-1 receptor,IL-1R)1、IL-1R3、白细胞介素-6 受体(interleukin-6 receptor,IL-6R),糖蛋白 130(glycoprotein 130,GP130)、肿瘤坏死因子受体 1(tumor necrosis factor receptor 1,TNFR1 or p55)和肿瘤坏死因子受体 2(tumor necrosis factor receptor 2,TNFR2 or p75)在 FLSs 中的表达情况;分别采用 IL-1β、IL-6、TNF-α三种促炎因子单独刺激或同时用胰岛素预先刺激FLSs,RT-qPCR技术检测 MMP-9、MMP-13 的变化,Western Blot 法检测 NF-KB、PI3K/Akt、mTOR三种信号通路的激活情况。结果:1.一定浓度梯度(0、100、200、500nmol/L)的胰岛素可明显增加FLSs的增值活性和炎性介质的表达,500nmol/L的胰岛素可增强FLSs趋化巨噬细胞的能力,同时使其趋化因子分泌量也显著增加。2.胰岛素对FLSs内PI3K/Akt、mTOR和NF-KB三种信号通路均有激活效应;三种信号通路的抑制剂能够显著逆转胰岛素介导的炎症反应。3.500nmol/L的胰岛素能够上调FLSs内IL-1β、IL-6、TNF-α三种促炎因子的细胞表面受体水平,而这三种信号通路的抑制剂均能逆转这一过程。与三种促炎因子单独刺激相比,用胰岛素预先刺激FLSs可使MMP-9和MMP-13的表达量以及三种信号通路的激活水平均有明显升高。结论:在一定浓度范围内,胰岛素可通过激活NF-KB、PI3K/Akt、mTOR三条信号通路加剧滑膜炎症,还可与促炎因子协同加重炎性反应的发生,放大滑膜炎症级联反应。本研究证实胰岛素参与介导OA的滑膜炎症病变,并且为寻找OA临床治疗的潜在靶标提供了理论支持。