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低氧是特殊环境生理、临床等领域经常涉及的病理生理现象。作为一种应激因素，低氧可导致呼吸系统、心血管系统等机体多功能损伤。随着西部大开发以及我国人口老龄化形势的日趋严峻，高原低氧环境导致的高原性疾病及老年人心血管疾病频发的挑战日趋紧迫，抗低氧药物的研发正受到越来越多的瞩目。
根据国内外药物抗低氧研究的文献报道，结合本实验室的具体情况，我们建立了用于筛选抗低氧药物的细胞模型，并运用其进行了抗低氧药物的筛选。采用功能追踪等方法拆分有抗低氧/缺血的当归、南酸枣、翠云草等中药，得到70余种药物成分，对其进行筛选，发现了36种药物成分具有抗低氧作用。其中，从当归注射液的筛选中获得了11种抗低氧单体化合物，而且在这些单体化合物中发现一种有抗低氧作用的新化合物。出乎意料的是，在筛选中我们发现含量最高且抗低氧作用显著的有效成分是一种糖代谢终产物5-羟甲基-2-糠醛(5-HMF)。在进一步的整体实验中发现，该化合物可延长小鼠在低氧状态下的存活。5-HMF主要由己糖加热分解产生，广泛存在于含有糖类物质的植物和食品中，一般中药制剂炮制或加热后5-HMF含量增加。近年来研究表明，该化合物具有抗氧化、改善血液流变学等对人体有利的作用，但其抗低氧作用尚未见报道[1]。本文通过在体和离体实验对5-HMF的抗低氧保护作用及其机制进行了初步的实验观察与分析。
1.抗低氧药物筛选模型的建立及抗低氧药物成分的筛选
采用ECV304细胞，以不同的接种密度及不同的低氧时间，选用黄芩苷为抗低氧阳性对照药物，建立细胞模型，用于抗低氧药物成分的筛选。用不同浓度的药物成分与ECV304细胞共孵育，对抗低氧药物成分进行筛选，结果显示：
1.1不同接种密度的ECV304细胞进行低氧处理12-24 h，可以引发细胞损伤，MTT法检测细胞存活降低，其损伤程度呈现密度依赖性和时间依赖性；阳性对照药物黄芩苷可以减轻低氧引发的细胞损伤，并具有剂量依赖性。
1.2采用ECV304细胞模型，将不同浓度的药物成份与ECV304细胞共孵育lh后，进行70余种抗低氧药物成分的筛选，先后共发现30余种药物成分具有抗低氧作用。其中，从当归注射液的筛选中获得了含量较高、抗低氧作用显著的有效成分5-HMF。
2.5-HMF的抗低氧保护作用及其机制探讨
2.1 5-HMF的抗低氧保护作用
为进一步确认5-HMF的抗低氧保护作用，我们分别从小鼠整体实验和ECV304细胞离体实验进行了验证。
2.1.1整体动物实验
采用低压氧舱和密闭瓶分别建立小鼠低压低氧和常压低氧模型。5-HMF(100mg/kg和1g/kg)灌胃给药4h后，观察小鼠存活时间。结果显示：
①低压低氧条件下，与空白对照组比较，给予5-HMFl g/kg和5-HMF100mg/kg组小鼠的存活时间均延长。
②常压低氧条件下，与空白对照组比较，给予5-HMFl g/kg组小鼠存活时间延长，给予5-HMF100 mg/kg组对小鼠存活时间影响不显著。
2.1.2离体实验
用不同浓度的5-HMF对ECV304细胞进行药物干预，通过MTT、细胞形态学观察及台盼蓝染色等方法，观察其抗低氧损伤作用。结果显示：
①与常氧组比较，低氧24 h后MTT检测，细胞存活率明显降低；6.5μg/ml、12.5μg/ml、25μg/mml和50μg/ml的5-HMF在细胞低氧后对细胞存活率未见明显影响，100μg/ml和200μg/ml的5-HMF能明显提高细胞在低氧后的存活率，而高浓度400μg/ml的5-HMF引起细胞存活率降低。
②采用倒置相差显微镜进行形态学观察，可以看到，低氧引起细胞发生水肿，部分细胞内部出现空洞等坏死性症状；200μg/ml的5-HMF可减轻低氧后引发的形态学改变，如细胞水肿减轻、结构相对完整等。
③台盼蓝染色计数结果显示，与常氧组比较，低氧组ECv304细胞死亡率明显升高，而200μg/ml的5-HMF抑制了低氧后细胞死亡率的升高。
2.25-HMF抗低氧保护作用的机制探讨
以上结果显示，5-HMF具有明显的抗低氧保护作用。5-HMF抗低氧作用的作用机制如何?我们猜测，5-HMF的抗低氧保护作用在细胞水平可能与减轻细胞凋亡和细胞坏死有关。为探讨其保护作用机制，实验选用200μg/ll的5-HMF对ECV304细胞进行药物干预，低氧24 h后，观察对细胞凋亡的影响，细胞线粒体膜电位(MMP)的变化，以及对乳酸脱氢酶(LDH)漏出率、细胞内p-ERK和ERK的表达变化和细胞内钙浓度的影响，最后分析5-HMF抗低氧作用的可能机制。
2.2.1用Annexin V&PI染色流式检测方法测定细胞凋亡的变化情况。结果显示，低氧24 h后，细胞凋亡率升高，而200μg/ml的5-HMF处理后，细胞凋亡率改善不明显。
2.2.2进一步用罗丹明123(Rhl123)染色流式检测方法测定细胞线粒体膜电位的变化。结果显示，低氧24h后，线粒体膜电位降低，而200μg/ml的5-HMF处理后，线粒体膜电位降低受到一定程度抑制，但与低氧对照组比较没有明显差别。
以上结果提示，5-HMF的抗低氧保护作用可能与抗细胞凋亡没有明显的关系。因此我们接下来检测了与细胞坏死相关的技术指标，以探讨5-HMF的抗低氧保护作用与抗细胞坏死之间的关系。
2.2.3以生化方法检测细胞LDH漏出率的变化。结果显示，低氧24 h后，细胞LDH漏出率明显升高，而200μg/ml的5-HMF处理后，明显抑制了低氧后LDH漏出率的升高。
2.2.4采用激光共聚焦方法观察细胞内钙浓度的变化。结果显示，低氧24 h后，细胞内钙荧光强度明显升高，而200μg/ml5-HMF处理的细胞胞内钙荧光强度明显低于低氧对照组。
2.2.5采用Western Blot技术方法观察细胞内p-ERK和ERK的表达变化。结果显示，低氧24 h后，细胞内ERK磷酸化水平增加，而200μg/ml5-HMF处理的细胞ERK磷酸化水平接近常氧组，表明5-HMF能减少细胞在应激状态下ERK途径的激活。
根据以上实验结果，我们可以初步得到以下结论：5-HMF的抗低氧保护作用可能主要是通过抑制严重低氧造成的细胞坏死来实现的，作用机制可能与其对钙超载和ERK激活的影响相关。
3结论
3.1建立了抗低氧药物筛选的细胞模型，并运用其进行了大量药物筛选。对70余种药物成分的筛选中先后共发现36种抗低氧药物成分。其中，从当归注射液的筛选中获得了11种抗低氧单体化合物，5-HMF是其中含量较高且抗低氧作用最为显著的单体化合物。
3.2首次在小鼠整体低氧模型中证实了5-HMF具有抗常压低氧和抗低压低氧的保护作用，提示5-HMF可能对高原低氧性疾病及老年人心血管疾病的防治均有潜在价值。
3.3首次在ECV304细胞低氧模型中证实了5-HMF具有抗低氧的保护作用。
3.4首次在细胞水平证实5-HMF的抗低氧保护作用可能与抗细胞凋亡的关系不明显，其作用可能主要与减轻细胞水肿，抗细胞坏死有关，作用机制可能与其对钙超载和ERK激活的影响相关。