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海洋生物提取物多具有抗肿瘤活性,扇贝是海洋生物的一种,由于其营养价值高且含有多种生理活性成分,因此在海洋抗癌药物研究中具有很好的应用和开发前景。本研究以海湾扇贝为原料,研究了海湾扇贝酶解物的制备、鉴定、抗肿瘤作用及其可能机制。主要研究结果如下:1.研究提出了海湾扇贝酶解物制备工艺条件,证明该酶解物具有较高的体外抗氧化活性。以去除内脏的海湾扇贝肉为原料,按固液比(g:m L)1:6.25加水匀浆,按1312.82U/g加入酸性蛋白酶,调节p H值到3.53,50℃恒温水解4 h,所得海湾扇贝酶解物的DPPH自由基清除率达到91.59%。进一步研究结果表明,10 mg/m L该酶解物的红细胞氧化溶血度(93.59%)与0.1 mg/m L Vc的红细胞氧化溶血度(96.63%)差异不显著,10 mg/m L该酶解物抗亚油酸过氧化能力(96.26%)显著高于1.0 mg/m L Vc(67.74%)和0.1 mg/m L Vc(40.65%)的抗亚油酸过氧化能力(P﹤0.05),说明该酶解物具有较高的抗氧化活性。2.测定了海湾扇贝酶解物的氨基酸组成及含量,鉴定了该酶解物中海湾扇贝多肽的一级结构。用柱前衍生反相高效液相色谱法测出海湾扇贝酶解物中包含14种游离氨基酸,多肽混合物中包含13种氨基酸,按含量由高到低依次为:精氨酸、半胱氨酸、组氨酸、苏氨酸、甘氨酸、脯氨酸、缬氨酸、天冬氨酸、赖氨酸、酪氨酸、甲硫氨酸、丝氨酸和亮氨酸。经串联飞行时间质谱法(MALDI TOF/TOF)鉴定,5个多肽组分的氨基酸序列分别为:组分1(m/z为706.3)Cys-Cys-Ser-His-Thr-Arg;组分2(m/z为718.3)Asn-Gly-Trp-Val-Thr-Arg;组分3(m/z为730.3)Gly-Asn-Pro-Met-Arg-Arg;组分4(m/z为741.4)Asp-His-Trp-Lys-Arg;组分5(m/z为908.5)Cys-Thr-Tyr-Gly-Pro-Val-Leu-Arg。3.研究了海湾扇贝酶解物对体外培养的两种肝癌细胞的影响,证明该酶解物的体外抗肿瘤效果。CCK-8法测出不同浓度海湾扇贝酶解物均能显著抑制人肝癌Hep G2和SMMC-7721细胞的生长(P<0.01),且抑制率随酶解物浓度的升高而增加。其中,12mg/m L海湾扇贝酶解物组的抑制率分别为60.4%和64.2%,显著高于其他组的抑制率(P<0.01);经倒置显微镜观察,该组两种细胞的形态较对照组均发生了明显改变,表现为细胞皱缩、透明度降低、细胞核固缩等,并出现了凋亡小体;经流式细胞仪分析,该组两种细胞的早期凋亡率和晚期凋亡率均显著升高(P<0.01);p53蛋白阳性率均显著增高(P<0.01),Bcl-2蛋白阳性率均显著降低(P<0.01)。由此可知,海湾扇贝酶解物体外抗肿瘤的作用机制可能为:①通过上调p53蛋白表达,阻滞细胞周期,并经半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶途径诱导细胞凋亡;②通过线粒体通路下调Bcl-2蛋白表达,诱导细胞凋亡。4.研究了灌胃海湾扇贝酶解物对H22荷瘤小鼠的影响,证明该酶解物的体内抗肿瘤效果。对H22荷瘤小鼠灌胃不同剂量的海湾扇贝酶解物后,低剂量组(500 mg/Kg·d-1)、中剂量组(1000 mg/Kg·d-1)和高剂量组(1500 mg/Kg·d-1)的抑瘤率分别为28.16%、41.93%和84.00%,具有量效依赖趋势。与模型组相比,中剂量组小鼠血清中MDA和8-iso-PGF2α的水平显著降低(P<0.05),SOD、IL-2、IL-12、GSH-Px和TNF-α的水平显著升高(P<0.05);中剂量组小鼠肿瘤组织提取液中突变型p53、Survivin、MDA、8-OHd G和8-iso-PGF2α的水平显著降低(P<0.05),SOD和GSH-Px的水平显著升高(P<0.05)。肿瘤组织病理学观察也表明该酶解物有较好的抗肿瘤生物学效应。以上结果证明,海湾扇贝酶解物对小鼠肝癌H22具有明显的抑制作用,且中剂量组效果较优。由此可知,海湾扇贝酶解物体内抗肿瘤的作用机制可能为:①通过提高机体的抗氧化能力和免疫功能而发挥作用;②通过调控相关细胞因子的水平,间接诱导肿瘤细胞凋亡;③通过降低某些凋亡抑制蛋白和肿瘤标志蛋白的表达水平,抑制肿瘤的发生和发展。