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过敏性哮喘是以气道高反应性(airwayhypersensitivity，AHR)、嗜酸性粒细胞和Th2细胞过度浸润以及血清高水平IgE为特征的慢性气道变应性炎症性疾病。目前研究认为，T淋巴细胞优势性分泌IL-4、IL-5、IL-13等Th2类细胞因子在过敏性哮喘的引发中扮演着重要角色。
Cd3001f(CD300antigenlikefamilymemberF)分子是一个氨基端带有信号肽、胞外段带有IgV样结构域、跨膜区、胞内段带有免疫受体酪氨酸抑制基序(immune-receptortyrosine-basedinhibitorymotifs，ITIM)和免疫受体酪氨酸转化基序(immune-receptortyrosine-basedswitchingmotif，ITSM)的I型糖蛋白，有研究显示，阻断或沉默树突状细胞表面Cd3001f分子的表达能够促进树突状细胞启动的T细胞增殖以及抗原特异性T细胞应答，表明Cd3001f分子具有负向调控树突状细胞启动T细胞应答的功能。
在本研究中，我们根据GenBank提供的小鼠Cd3001f基因核酸序列(NM145634.3)，设计含完整开放阅读框(openreadingframe，ORF)的Cd3001f基因特异性引物，采用反转录聚合酶链式反应(reversetranscription-polymerasechainreaction，RT-PCR)从小鼠骨髓来源树突状细胞(bonemarrow-deriveddendriticcells，BMDCs)中扩增得到Cd3001f基因，将其与pMD-18T载体连接构建重组质粒pMD-Cd3001f。经生物信息学分后，设计特异性引物以重组质粒pMD-Cd3001f为模板聚合酶链式反应(polymerasechainreaction，PCR)扩增Cd3001f基因编码区不合信号肽的胞外段，将其与pGEX-4T-3载体连接构建原核表达质粒pGEX-Cd3001f(22aa-185aa)。原核表达质粒载体转化大肠杆菌Rosetta(E3)后，经IPTG诱导表达了约45.5kD的GST-Cd3001f(22aa-185aa)融合蛋白。表达产物经GSTrapFF亲和层析柱纯化后皮下免疫接种新西兰大白兔，制备了抗GST-Cd3001f(22aa-185aa)融合蛋白多克隆抗体。酶联免疫吸附试验(enzyme-linkedimmunosorbentassay，ELISA)结果显示，其抗体效价高达1:16384。将Cd3001f基因真核表达质粒转染人胚胎肾细胞(humanembryonickidney293cells，HEK293)，间接免疫荧光实验(indirectimmunofluorescenceassays，IIFA)和免疫印迹实验(Westernblot)检测兔抗GST-Cd3001f(22-185aa)融合蛋白多克隆抗体的特异性。结果显示，该多克隆抗体能够特异性的识别Cd3001f真核表达蛋白。
根据siRNA设计原则，设计5对小鼠Cd3001f基因保守序列编码短发卡RNA(shorthairpinRNA，shRNA)的正义、反义寡核苷酸链，将其退火后分别克隆至pLL3.7质粒载体中获得Cd3001f基因shRNA表达质粒。采用脂质体法，分别将Cd3001f基因shRNA表达质粒与Cd3001f基因真核表达质粒pCDNA-Cd3001f共转染HEK293细胞48小时。Real-timePCR分析显示，重组质粒pLL-Cd3001f-shRNAe对Cd3001f基因mRNA抑制率为75.6％。以重组质粒pMD18-Cd3001f为模板PCR扩增Cd3001f基因，将其插入穿梭质粒pAdTrack-CMV中。以重组质粒pLL-Cd3001f-shRNAe为模板PCR扩增含U6启动子的Cd3001f基因shRNA，将其插入穿梭质粒pAdTrack中。PmeⅠ酶切阳性重组质粒后转化含重组腺病毒骨架质粒Adeasy-1的感受态菌BJ5183，进行同源重组。PacⅠ酶切重组腺病毒载体后，脂质体法转染HEK293细胞。转染后12-18天，获得重组腺病毒Ad-Cd3001f、Ad-Cd3001f-shRNA。大量扩增重组腺病毒，并采用CsCl密度梯度离心法进行纯化。重组腺病毒Ad-Cd3001f滴度为1.4×109PFU/ml，Ad-Cd3001f-shRNA滴度为2.6×109PFU/ml。以感染复数(amultiplicityofinfection，MOI)为75的重组腺病毒感染BMDCs48小时。Real-timePCR分析显示，Ad-Cd3001f感染细胞中Cd3001f基因mRNA的表达水平显著升高，而Ad-Cd3001f-shRNA感染细胞中Cd3001f基因mRNA表达水平下降达51.7%。Westernblot分析显示，Ad-Cd3001f感染细胞特异性地表达了Cd3001f蛋白。
分别于第0天、第14天给C57BL/6小鼠腹腔注射经凝胶佐剂乳化的卵清白蛋白(ovalbumin，OVA)，第二次致敏后10天OVA溶液连续激发3天。以MOI为75的重组腺病毒Ad-Cd3001f(DC-Cd3001f)和Ad-Cd3001f-shRNA(DC-siCd3001f)分别感染培养5天的BMDCs24小时，再用OVA激发24小时。分别于OVA首次致敏前7天和致敏后3天小鼠腹腔注射DC-Cd3001f或DC-siCd3001f。最后一次激发后24小时，检测气道高反应性。吉姆萨瑞氏染色行肺泡灌洗液炎性细胞分类计数。H&E和PAS染色观察肺组织病理学变化。ELISA检测支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolarlavagefluid，BALF)、脾细胞培养上清中IL-4、IL-5、IL-13和IFN-γ的含量。流式细胞术检测脾细胞中CD4+Foxp3+Tregs和CD4+IL-17A+Th17的百分比。研究结果显示，DC-siCd3001f免疫哮喘小鼠后能够减轻气道高反应性和肺组织炎症，降低肺泡灌洗液和脾细胞培养上清中IL-4、IL-5和IL-13的分泌，提高脾细胞中CD4+Foxp3+Tregs的百分比，降低脾细胞中CD4+IL-17A+Th17的百分比。
综上所述，过继性回输DC-siCd3001f能够显著降低哮喘小鼠的气道高反应性，抑制气道炎症，减少Th2类细胞因子的分泌以及引发脾脏中高比例的CD4+FoxP3+Tregs和低比例的CD4+IL-17A+Th17，为哮喘的治疗提供了新思路。