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背景: 海水淹溺是引起意外性死亡的最常见原因之一。而淹溺后人体吸入海水引起的损伤也会带来显著的社会和公共卫生问题。急性肺损伤（acute lung injury, ALI）和急性呼吸窘迫综合征（acute respiratory distress syndrome, ARDS）是海水吸入后导致的最常见的并发症。在海水吸入引起的肺损伤中，肺泡上皮和微血管内皮屏障损伤是引起炎细胞以及水肿液渗出和浸润的基础形态改变。而肺泡细胞尤其是肺微血管内皮细胞层在海水刺激下发生的凋亡又是引起肺泡气血屏障损伤的重要原因。因此，抑制肺微血管内皮凋亡的发生和进展在海水吸入性肺损伤的治疗中有重要作用。 内质网是负责蛋白生物合成和修饰的主要细胞器。当细胞受到损伤因素刺激时，内质网的蛋白合成方式会产生改变，而在受损伤的细胞中蛋白折叠相关的应激反应也随之产生。内质网应激反应（Endoplasmic reticulum stress, ER stress）能够诱发未折叠蛋白反应（unfolded protein response, UPR）。未折叠蛋白反应是细胞的一种自适应反应，而持续过度的未折叠蛋白反应最终会引起细胞凋亡的发生。未折叠蛋白反应的激活是由内质网上的三种跨膜蛋白引发的，分别为IRE1、PERK和ATF6。其中IRE1和PERK通路的激活参与了内质网应激诱导凋亡的发生。PERK通路的激活最终会导致CHOP的上调，该蛋白主要通过调节bcl-2家族的表达来诱发细胞凋亡反应。IRE1通路诱导凋亡是通过激活JNK分子（细胞凋亡线粒体通路的关键启动分子）实现的。我们在此前的研究中发现，PERK-CHOP通路的激活参与了海水吸入性肺损伤诱导细胞凋亡的发生，另一方面，海水刺激引起的细胞凋亡同时也与JNK通路的激活有着密切的联系，但内质网应激反应中 IRE1 通路是否对海水刺激后 JNK 的激活起到调节作用尚需证实。 机体中除了我们所熟知的肾素-血管紧张素系统（RAS）之外，在肺血管内皮细胞中还存在着一个内源性的（即系统中所有因素都由细胞产生）血管紧张素体系。该体系包含了经典的血管紧张素 II（ANGII）以及其拮抗系统血管紧张素转换酶-2 （ACE-2）/血管紧张素 1-7（ANG1-7）分子。我们之前的研究表明，海水的刺激会引起ANGII表达增加而抑制ACE-2/ANG1-7的表达，而ANGII受体AT1拮抗药物氯沙坦的作用能够减轻海水吸入性肺损伤中炎症反应、肺水肿和细胞凋亡的发生。该药物在抑制凋亡方面同样是通过抑制JNK通路的活化起作用的。此外，JNK通路的激活作为内质网应激诱导凋亡的关键反应，综合来看，ANGII/ ANG1-7体系是否在内质网应激诱导的凋亡中发挥调控作用也需要进一步的验证。本实验中通过建立大鼠肺组织以及大鼠肺微血管内皮细胞（RPMVECs）的海水肺损伤模型，对ANGII/ANG1-7 体系在海水吸入性肺损伤中对内质网应激反应诱导凋亡的调节作用进行了探究。并根据机制研究，引入了串联基因的靶向治疗方案。 目的: 通过建立大鼠以及RPMVECs细胞的海水肺损伤模型，探究ANGII/ANG1-7体系在海水吸入性肺损伤中对内质网应激反应诱导凋亡的调节作用。并根据机制研究，引入了串联基因的靶向治疗方案并检测对海水诱导凋亡的抑制效果。 方法: 第一部分：建立了SD大鼠和RPMVECs细胞的海水吸入性肺损伤模型，检测了内质网应激抑制剂4-PBA对海水刺激后肺组织病理改变（H-E染色）、湿干比、伊文思蓝通透性的作用。Western blot法检测了大鼠肺组织及RPMVECs细胞中海水刺激后内质网应激相关蛋白Grp78、CHOP、p-IRE1、XBP1s的表达以及细胞凋亡相关蛋白cleaved-caspase3、bax、bcl-2的表达，同时检测了内质网应激抑制剂4-PBA对这些蛋白的抑制效果。此外，用流式细胞仪检测了RPMVECs细胞凋亡率的改变。 第二部分：Western blot法检测了海水刺激后ACE-2蛋白的表达，ELISA法检测了ANGII以及ANG1-7分子表达的变化，同时检测了内质网应激抑制剂4-PBA对这些蛋白表达的影响。进一步利用IRE1抑制剂4μ8C和PERK抑制剂GSK2656157检测了这两条内质网应激通路对RPMVECs细胞中ANGII/ANG1-7体系的影响。另外，引入ANGII受体AT1抑制剂Saralasin（SAR）以及ANG1-7分子及其受体Mas抑制剂A779，检测了ANGII/ANG1-7体系在海水吸入性肺损伤中对内质网应激反应诱导凋亡的调节作用，并验证了该调节作用与JNK通路的关系。 第三部分：根据前两部分中ACE-2/ANG1-7体系在海水刺激后内质网应激诱导的凋亡中起保护作用，以及XBP1s分子的表达特性，我们设计并以质粒为载体构建了启动子（promoter）-ACE-2基因-ANG1-7基因的串联基因，其中promoter是能够与XBP1s相结合的其下游基因的启动子。通过基因库查询及相关检测，最终确定了XBP1s下游基因wfs1的启动序列作为该串联基因的启动子。将此串联基因质粒转染至RPMVECs细胞中，检测了其对海水刺激后细胞凋亡的影响。 结果: 第一部分：海水吸入后大鼠肺组织出现了显著的病理改变，同时湿干比以及伊文思蓝通透性检测也出现了显著的增加。海水刺激以及内质网应激激动剂MG132同时引起了内质网应激标志蛋白CHOP、Grp78的表达增加，同时也激活了与凋亡密切相关的IRE1-XBP1s信号通路。另外，海水刺激及MG132的作用也都增加了细胞凋亡率以及凋亡相关蛋白cleaved-caspase 3和bax的表达，抑制了抗凋亡蛋白bcl-2的表达。此外，应用内质网应激反应抑制剂4-PBA预处理后，在抑制内质网应激相关蛋白表达的同时，也抑制了细胞凋亡的发生。 第二部分：海水以及内质网应激激动剂MG132刺激后，RPMVECs细胞中ANG II分子的表达显著增加，而ACE-2及ANG1-7蛋白的表达则受到显著的抑制。同时细胞凋亡也出现了显著的增加，表现在凋亡蛋白cleaved-caspase 3和bax含量增加，而抗凋亡蛋白bcl-2的表达则受到了抑制。另一方面，应用内质网应激抑制剂4-PBA作用后，在大鼠肺组织和RPMVECs细胞中ANG II的表达受到了抑制，且使ACE-2及ANG1-7蛋白表达回调，同时细胞凋亡的情况也得到了缓解。进一步的研究发现，内质网应激 IRE1 通路抑制剂 4μ8C 作用后出现了 ANG II 表达的抑制以及ACE-2/ANG1-7表达的回升、而PERK通路抑制剂GSK2656157作用后效果并不明显。另外，在海水刺激以及MG132刺激之前给予ANG II分子受体AT1抑制剂SAR预处理后，凋亡蛋白cleaved-caspase 3和bax的表达受到了抑制，而抗凋亡蛋白bcl-2的表达则出现了相应的回升。另一方面，在海水刺激以及MG132刺激之前给予ANG 1-7分子预处理后，同样也出现了凋亡蛋白cleaved-caspase 3和bax的表达受到抑制和抗凋亡蛋白bcl-2的表达出现回升的现象。进一步在海水刺激以及MG132刺激之前给予ANG 1-7分子受体Mas抑制剂A779预处理后，表现出了ANG 1-7分子阻断后的效果，即凋亡反应的发生受到抑制的效果发生了缓解，说明 ANG1-7 分子能够抑制海水刺激后内质网应激途径引起的细胞凋亡是通过与其受体Mas相互作用而产生效果的。此外，海水及 MG132 的刺激都出现了 JNK 分子显著的磷酸化激活，给予ANG II分子受体AT1抑制剂SAR预处理后，JNK分子的磷酸化水平受到了抑制。给予ANG1-7分子后，JNK分子的磷酸化水平也受到了一定程度的抑制。给予ANG1-7分子的同时加入Mas受体拮抗剂A779后，JNK分子的磷酸化出现了进一步的增加。这些结果说明了ANG II/ANG1-7体系对海水刺激后内质网应激反应诱导凋亡的调节是通过JNK通路实现的。 第三部分：首先，设计并合成了XBP1s下游基因promoter-ACE-2基因-ANG1-7基因的串联基因，经基因库查询以及特异性分析后，我们选择了与XBP1s结合特异性较好的wfs1以及atf3基因启动子，通过PCR检测后，发现海水以及MG132刺激后，wfs1基因的表达要高于atf3，即wfs1启动序列与XBP1s结合的特异性更高，因此串联基因的合成选择了wfs1的启动序列作为开始的promoter。海水刺激后，转染了串联基因的RPMVECs细胞中ACE-2 mRNA表达显著增加，且随着转染浓度的提高，表达量越多。此外，在没有海水刺激的情况下，空白对照组以及串联基因质粒的转染组ACE-2蛋白及ANG1-7分子的表达几乎一样。海水刺激后，细胞内ACE-2蛋白以及 ANG1-7 分子明显下降，而转染了串联基因后再用海水进行刺激，细胞内ACE-2 蛋白以及 ANG1-7分子表达显著增加，这说明串联基因在海水刺激后出现了显著的激活。另外，在没有海水刺激的情况下，空白对照组以及串联基因质粒转染组细胞凋亡率很低，且凋亡相关蛋白cleaved-caspase 3和bax以及凋亡相关通路JNK磷酸化的表达也处于比较低的水平，而抗凋亡蛋白bcl-2的表达则处于比较高的水平。海水刺激后，无质粒转染的细胞凋亡率迅速上升，且凋亡相关蛋白cleaved-caspase 3和bax的表达也显著增加，而抗凋亡蛋白bcl-2的表达则处于比较低的水平。此外，凋亡相关信号通路JNK的磷酸化水平也显著增加，而转染了串联基因后再用海水进行刺激，细胞中凋亡率显著下降，且凋亡相关蛋白cleaved-caspase 3和bax以及凋亡相关分子磷酸化JNK的表达也显著降低，而抗凋亡蛋白bcl-2的表达出现了回升。 结论: 1、海水刺激激活了内质网应激反应并最终导致了细胞凋亡的发生。IRE1-JNK通路的激活在海水吸入性肺损伤中内质网应激反应诱导的细胞凋亡中起到了关键作用。 2、海水吸入性肺损伤中内质网应激反应（主要为IRE1通路的激活）促进了ANGII的表达，而ACE-2/ANG1-7的表达受到了抑制。 3、海水吸入性肺损伤中，ANGII及AT1受体相互作用促进了内质网应激反应诱发的细胞凋亡，而ANG1-7及其受体Mas的相互作用抑制了内质网应激反应诱发的细胞凋亡，且该凋亡途径与JNK通路相关。 4、海水刺激后诱发的内质网应激反应中IRE1的激活引起了XBP1u的剪切，使细胞内快速的表达出XBP1s，我们利用这一反应特性，设计合成了启动子（promoter）-ACE-2基因-ANG1-7基因的串联基因，其中promoter是能够与XBP1s相结合的其下游基因的启动子。将该串联基因质粒转染至细胞后，大大减轻了海水刺激后内质网应激反应诱导的细胞凋亡的发生。