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新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)是一种溶癌病毒,可在肿瘤细胞内增殖、抑制并裂解肿瘤细胞。研究发现,NDV的包膜糖蛋白血凝素-神经氨酸酶(hemagglutinin-neuraminidase,HN)基因是NDV抗肿瘤的功能性基因,是NDV抗肿瘤作用的重要分子基础。IL-18具有明显的抗肿瘤作用,在肿瘤治疗和肿瘤基因治疗方面具有潜在的应用前景。为探讨HN基因及IL-18基因融合后抗肿瘤作用及其机制,本研究分别构建了HN基因、ChMIL-18基因及HN基因和ChMIL-18基因融合后的重组表达载体pPICZαA-HN、pPICZαA-ChMIL18和pPICZαA-HN-ChMIL18,经诱导表达后,其目的蛋白均具生物学活性,进而以鸡马立克病肿瘤细胞系-MSB-1为体外研究对象,对MSB-1细胞的增殖抑制作用及其机制等方面进行了初步研究,结果表明,HN蛋白、HN-ChMIL18融合蛋白均可抑制肿瘤细胞生长,HN-ChMIL18融合蛋白对细胞抑制作用明显强与HN蛋白,其原因可能是ChMIL-18蛋白对HN蛋白致肿瘤细胞凋亡有增强作用,而ChMIL-18蛋白虽具有淋巴细胞增殖活性,但对肿瘤细胞无明显的抑制作用,其为进一步研究HN基因和ChMIL-18基因融合蛋白体内抗马立克肿瘤奠定了基础,具有重要的理论和实际意义。1目的基因的获得及生物信息学分析1.1 ChMIL-18目的基因的获得根据Genbank中鸡IL-18成熟蛋白基因序列设计一对特异性引物,利用RT-PCR技术,从外周血淋巴细胞中扩增到了鸡IL-18成熟蛋白基因全序列,将其克隆至pMD18-T载体并测序,对测序结果进行生物信息学分析,结果表明:序列全长为507bp,其理论分子量为19.5KD,等电点为6.36,无糖基化位点,具抗原性等。为提高具有生物活性的ChIL-18的表达量,应用反向长距离PCR定点突变技术对鸡IL-18成熟蛋白基因第28位和第37位的Arg密码子进行同义突变,将毕赤酵母中低频密码子CGA突变为高频密码子AGA,获得突变体pMD18-T-ChMIL18,将其转化至E.coli JM109中,抽提质粒,经酶切和PCR鉴定后,进行测序,测序结果与原ChIL18比对表明突变成功,获得了目的突变基因。1.2 HN基因的获得应用RT-PCR方法对NDV LaSota株HN基因进行了扩增与克隆,得到大小约为1.7Kb的LaSota株HN基因,与Genbank中登录的HN基因大小一致:扩增序列经PCR、酶切鉴定及序列测定证实与预计结果相符:用DNAStar及在线分析软件对HN基因的生物信息学进行分析,其结果为:HN基因共577个氨基酸,理论分子量为63.0KD,等电点为7.54,12个半胱氨酸残基,5个N-糖基化位点,与B1、Clone30、LaSota、JI1和HB92核苷酸同源性在98.8%-99.8%,氨基酸同源性分别为98.8%-99.5%。1.3 HN-ChMIL18融合基因的获得根据表达载体pPICZαA及克隆载体pBluescript SK+(pBS SK+)的多克隆位点,设计HN基因的引物(含柔性接头),在两端分别引入KpnI和BamHI酶切位点,以及变构体MIL-18引物(含柔性接头),在两端分别引入BamHI和NotI酶切位点。分别以pMD18-T-HN、pMD18-T-ChMIL18为模板扩增得到融合基因片段HN~f和ChMIL-18~f,并克隆至pMD18-T载体,构建了克隆载体pMD18-T-HN~f、pMD18-T-ChMIL18~f。重组质粒pMD18-T-HN~f和pBS SK+分别用/KpnI/BamHI双酶切,片段回收产物按适当比例连接,转化E.coli JM109感受态细胞,重组质粒命名为pBS SK+-HN。然后,重组质粒pMD18-T-ChMIL18~f和pBS SK+-HN分别用BamHI、NotI双酶切,回收产物按适当比例连接,转化E.coli JM109感受态细胞,重组质粒鉴定正确后命名为pBS SK+-HN-ChMIL18,经酶切、PCR鉴定及序列比对表明获得了目的基因HN-ChMIL18。2表达载体的构建、诱导表达及表达产物的活性检测2.1表达载体pPICZαA-ChMIL18的构建、诱导表达及表达产物的活性检测质粒pMD18-T-ChMIL18和pPICZαA分别用EcoRl、KpnI双酶切,电泳回收纯化ChMIL18和pPICZαA双酶切产物,按适当比例进行连接,转化到E.coli JM109感受态细胞中,鉴定结果表明获得了重组质粒pPICZαA-ChMIL18。将重组质粒pPICZαA-ChMIL18用SacI酶切线性化,电脉冲方法克隆至Pichia Pastoris(P.Pastoris)X-33感受态细胞中,经高抗性筛选、PCR鉴定结果表明pPICZαA-ChMIL18已整合入P.Pastoris X-33染色体中,用1%甲醇对其进行诱导表达,SDS-PAGE结果表明目的蛋白存在于上清中,分子量约为23KD,Western blot结果表明表达产物具良好的免疫原性,淋巴细胞转化试验结果表明ChMIL18具有促淋巴细胞增殖的活性。2.2表达载体pPICZαA—HN的构建、诱导表达及表达产物的活性检测质粒pPICZαA和重组质粒pMD18-T-HN分别用KpnI/NotI双酶切,电泳回收纯化HN和pPICZαA片段,按适当的比例进行连接,克隆至E.coli JM109感受态细胞中,经酶切及PCR鉴定,结果表明获得了重组质粒pPICZαA-HN。重组质粒pPICZαA-HN用SacI酶切线性化,电击转化入P.Pastoris X-33感受态细胞中,经高抗性筛选、PCR鉴定证明pPICZαA-HN已整合入X-33的染色体上,对其进行诱导表达,SDS-PAGE、Western-blot及血凝试验结果表明上清中有目的蛋白,其分子量约为97KD,且具良好的免疫原性和凝集红细胞的活性。2.3表达载体pPICZαA-HN-ChMIL18的构建、诱导表达及表达产物的活性检测质粒pBS SK+ -HN-ChMIL18和pPICZαA分别用KpnI/NotI双酶切,电泳回收HN-ChMIL18与pPICZαA双酶切产物并纯化,按适当比例进行连接,克隆至E.coliJM109感受态细胞,酶切及PCR鉴定结果表明获得了重组质粒pPICZαA-HN-ChMIL18。重组质粒pPICZαA-HN-ChMIL18用SacI酶切线性化后,电击转化入酵母菌X-33感受态细胞中,高抗性筛选和PCR鉴定结果表明pPICZαA-HN-ChMIL18已整合入X-33染色体上,对其进行诱导表达,SDS-PAGE、Western-blot结果表明目的蛋白为分泌性表达,分子量约为103KD,具良好的免疫原性,同时,淋巴细胞转化试验、血凝试验证明表达产物具有促进淋巴细胞增殖和凝集红细胞的活性。3体外抗马立克肿瘤细胞系MSB-1的初步研究以马立克氏病肿瘤细胞系-MSB-1为体外研究对象,分别将ChMIL-18蛋白、HN蛋白、HN-ChMIL18融合蛋白与MSB-1细胞共培养后,通过增殖抑制试验、琼脂糖凝胶电泳、流式细胞仪等方法探讨其抑制机制,MTT结果表明HN蛋白、HN-ChMIL18融合蛋白对MsB-1细胞的增殖有抑制作用,并呈剂量相关性,而ChMIL-18蛋白无抑制作用;琼脂糖凝胶电泳分析发现,ChMIL-18蛋白、HN蛋白、HN-ChMIL18融合蛋白与MSB-1细胞共培养一段时间后,HN蛋白、HN-ChMIL18融合蛋白均出现DNA断裂现象;ChMIL-18蛋白、HN蛋白、HN-ChMIL18融合蛋白与MSB-1细胞共培养后,流式细胞仪检测发现HN蛋白、HN-ChMIL18融合蛋白均引起MSB-1细胞出现了凋亡,而且HN-ChMIL18融合蛋白引起的凋亡数量比HN蛋白多,而单独的ChMIL18不能引起MSB-1细胞凋亡。