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背景与目的叉头蛋白O1（forkhead box protein O1,FoxO1）是一种重要的转录因子,参与细胞凋亡、DNA损伤修复、肿瘤发生和糖代谢等多种生命过程,FoxO1在细胞核中与FoxO1-DNA结合位点相结合,通过其下游转录因子KLF2调节S1P1、CD62L和CCR7的表达。Kruppel-样因子2（Kruppel-like factor2,KLF2）也是一种转录因子,受FoxO1的调控。近年来研究发现,鞘胺醇-1-磷酸受体（sphingosine-1-phosphate receptor 1,S1P1）是胸腺发育成熟T细胞迁出胸腺的关键分子。有研究报道,在胸腺增生型重症肌无力（MG）患者胸腺中,出现FoxO1、KLF2和S1P1高水平表达,而且Fox O1-KLF2-S1P1通路的作用已经在小鼠体内胸腺细胞分化与迁出中得到验证。另外,FoxO1对下游分子KLF2、S1P1、CD62L、CCR7的调控作用与其在细胞内的定位及磷酸化状态有关,PI3K-Akt信号通路的活化可诱导细胞核内FoxO1的磷酸化,磷酸化的FoxO1,从胞核迁出进入胞浆,失去转录活性。有研究发现miRNA参与T细胞的发育,mi R-17-92是目前已证实参与T细胞发育过程的miRNA之一,mi R-17-92和FoxO1在不同环境和疾病条件下,可正向调节Tfh分化。本科研团队在对重症肌无力患者胸腺组织进行miRNA基因芯片筛查中发现miR-19a-3p表达与正常胸腺组织存在显著差异。文献资料显示,miR-19a-3p是一种在脊椎动物中广泛保守的microRNA,在T细胞分化、成熟、迁移和活化过程中,miR-19a-3p与FoxO1及其下游分子表达有何关系,调控机制如何,现有报道尚少。我们选择来自人急性T淋巴细胞白血病的CD8+细胞毒性T细胞系—TALL-104细胞,探讨磷酸化、去磷酸化以及miR-19a-3p对细胞增殖、凋亡和FoxO1-KLF2-S1P1通路的影响,为进一步探讨T细胞分化机制提供试验依据。方法人白血病T淋巴细胞系TALL-104购于深圳豪地华拓生物公司,用含有10%FBS的RPMI1640培养基在37℃、5%CO2的培养箱中传代培养,每天均加入rhIL-2 200IU/ml。细胞传代2次后进行实验操作。（1）TALL-104细胞的FoxO1磷酸化和去磷酸化。分三组进行试验:（1）磷酸化处理组,CD3单抗和CD28单抗共刺激;（2）去磷酸化处理组,PI3K-AKT抑制剂LY294002处理;（3）空白对照组,不加任何刺激。置37℃、5%CO2培养箱培养,于3h、6h、12h、24h、48h后分别提取RNA和蛋白质。（2）miR-19a-3p mimic转染。miR-19a-3p mimic和miR-NC分别用lipofectamine3000转染,miR-19a-3p mimic和miR-NC转染终浓度为50nM。同时设置空白组。分别于转染后12h,24h,48h,72h提取miRNA和mRNA。（3）细胞增殖试验,用CFSE染TALL-104细胞,终浓度为5μM,染色后于37℃培养箱中平衡12h后,miR-19a-3p mimic转染TALL-104细胞,于12h、24h、48h、72h后进行流式细胞检测。（4）细胞凋亡检测,采用Annexin V-FITC/PI染色法,对转染mi R-19a-3p mimic和miR-NC的TALL-104细胞进行细胞凋亡检测,于转染后48h、72h后收集细胞,上流式细胞仪检测。（5）实时荧光定量PCR检测。收集步骤2中各组细胞,提取mi RNA,实时荧光定量PCR检测mi RNA的表达水平,测得转染miR-19a-3p mimic后TALL-104细胞中miR-19a-3p的表达变化。收集步骤1和2中各组细胞,提取细胞中的总RNA,测定RNA纯度和浓度后,实时荧光定量PCR检测mRNA的表达水平,测得TALL-104细胞磷酸化和去磷酸化前后各组基因的相对表达的差异,测得miR-19a-3p转染后各组基因的相对表达的差异。（6）Western Blot检测,收集步骤2中三组细胞,提取细胞中的总蛋白,BCA法测蛋白浓度,经10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）后,转膜,用含5%BSA的TBST封闭后,一抗4℃孵育过夜,洗脱一抗后再与HRP标记的羊抗兔二抗室温孵育2h,洗脱二抗,加化学发光试剂后迅速将膜放入Bio-Rad凝胶成像仪的暗室中曝光。（7）统计学分析,应用SPSS 21.0统计软件分析数据。两组样本之间采用t检验,以P<0.05为差异有统计学意义。结果（1）CD3单抗和CD28单抗刺激TALL-104细胞,使pFoxO1蛋白表达升高,FoxO1（0.90±0.08）及其下游分子KLF2（0.33±0.03）和S1P1（0.65±0.09）等mRNA水平和蛋白表达持续处于低水平;LY294002处理TALL-104细胞后,pFoxO1蛋白质表达下调,FoxO1（9.63±0.64）、KLF2（1.21±0.07）和S1P1（2.91±0.38）mRNA及蛋白表达上调,与空白组和磷酸化组相比有显著差异（P<0.01）。（2）miR-19a-3p mimic转染TALL-104细胞后miR-19a-3p（52.03±0.82）表达的出现明显上调（P<0.01）。（3）miR-19a-3p mimic转染TALL-104细胞,细胞增殖未发现显著变化（P>0.05）,但细胞凋亡受抑制（P<0.05）。（4）mi R-19a-3p mimic转染TALL-104细胞,BCL2（1.23±0.03）一过性增高,FoxO1（1.30±0.05）、KLF2（1.94±0.04）mRNA水平在早期出现上调（P<0.05）,随即FoxO1（0.71±0.05）、KLF2（0.11±0.01）、S1P1（0.62±0.05）表达均显著受抑制（P<0.05）,而SOCS3（3.30±0.26）表达在48h呈现明显上调（P<0.01）,STAT3（0.73±0.02）、BCL2（0.78±0.03）无显著变化（P>0.05）。结论mi R-19a-3p能通过调节TALL-104细胞的FoxO1磷酸化、和SOCS3和BCL2的表达而影响细胞生存和凋亡。