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目的:幽门螺杆菌(H.pylori)Hpsh0459蛋白由位于H.pylori可塑区(TnPZ)中的hpsh0459基因编码,有研究认为该基因的编码产物可以与H.pylori TnPZ中的其他基因(virB4,virB8,virB9,virB11,virD4和virD2)编码产物共同构成一个新的IV型分泌系统(tfs3a)。目前国内外尚缺乏对hpsh0459基因及其编码产物Hpsh0459的功能及相关致病机制的研究报道。本文以H.pylori临床分离菌株WH-21为研究对象,通过分子生物学、生物信息学和免疫学等技术手段对hpsh0459基因及其编码产物Hpsh0459的功能进行了探究,为深入研究其在H.pylori致病机制中的地位及作用奠定了基础。方法:1.将H.pylori WH-21菌株于微需氧环境中在Karmali培养基上培养,采用PCR手段,以H.pylori WH-21菌株基因组为模板,用特异性引物扩增hpsh0459基因片段,经测序后得到核酸序列,并推导出编码氨基酸序列。采用生物信息学,分析hpsh0459基因推导蛋白的基本理化性质、细胞定位、信号肽及空间结构等相关信息;2.构建hpsh0459基因的原核表达载体,转化至E.coli Rosetta(DE3)中,以IPTG诱导宿主表达融合蛋白Hpsh0459。用Ni2+-NTA亲和层析柱对融合蛋白进行纯化,并采用Western blot对其所携带的His标签进行鉴定。以纯化后的Hpsh0459为抗原,通过免疫家兔制备抗-Hpsh0459多克隆抗体,抗体效价通过ELISA方法测定;3.将不同浓度的纯化Hpsh0459蛋白与人正常胃上皮细胞GES-1进行共培养,用MTT方法研究其细胞毒性。将共培养后的上清培养液收集,用IL-8检测试剂盒(elisa)法检测其中的il-8含量;4.采用低温超速离心法将h.pyloriwh-21菌株的菌体成分裂解为不同的亚细胞组分,以兔抗hpsh0459多克隆抗体为一抗,以免疫印迹法对hpsh0459的亚细胞定位进行检测。用免疫共沉淀联合质谱分析的手段,探究hpsh0459的互作蛋白;5.构建hpsh0459基因敲除载体,用于建立hpsh0459的基因缺失株。结果:1.以h.pyloriwh-21菌株为模板,成功获得了长度为1233bp的hpsh0459基因全长片段。生物信息学分析显示,该基因可编码分子量为46.31kda的蛋白质,该蛋白由411个氨基组成。该蛋白的等电点为9.45,属于无信号肽的亲水性稳定蛋白,其抗原位点聚集于c端,空间结构呈通道状,提示hpsh0459蛋白可能参与细胞生物大分子的转运。2.构建了hpsh0459基因的原核表达载体pet28a-hpsh0459(633bp),经诱导纯化后获得了高纯度的hpsh0459的c端蛋白。通过免疫家兔,获得了效价为1:32,000的兔抗-hpsh0459多克隆抗体。3.hpsh0459蛋白与ges-1共培养后,通过mtt实验和elisa法对hpsh0459蛋白的细胞毒性和上清液il-8含量进行了分析。结果表明hpsh0459蛋白的细胞毒性有浓度依赖性,hpsh0459浓度为0.1μg/ml时的细胞抑制率明显低于hpsh0459浓度为20μg/ml时的细胞抑制率(3.02%±0.02%vs57.57%±0.03%,p<0.01)。随共培养时间的延长,24h(1316.31±212.78pg/ml)和12h(1043.44±210.88pg/ml)的il-8水平明显高于共培养6h的il-8水平(97.22±11.47pg/ml,p<0.01)。表明该蛋白能明显刺激细胞il-8的分泌,与宿主炎症反应的发生有关。4.以兔抗-hpsh0459多克隆抗体为一抗,分别采用免疫印迹法和免疫共沉淀联合质谱分析的方法明确了hpsh0459蛋白的亚细胞定位及互作蛋白。结果表明,hpsh0459定位于细胞膜和细胞周质上,与锌指蛋白和蛋氨酸转运atp结合蛋白等存在相互作用。5.成功构建了hpsh0459基因的敲除载体pbluekm40-?hpsh0459::kan。结论:1.通过信息分析,明确了hpsh0459是一种高亲水性的稳定性蛋白,有较强的抗原性,该蛋白与virb10、trbi家族蛋白具有较高的同源性。其空间结构呈中空的通道状,可能与周边的其他virB基因组成一个新的T4SS。2.通过构建hpsh0459原核表达载体pET-28a-hpsh0459(633bp),获得了目的蛋白和高效价的兔源Hpsh0459多克隆抗体。3.明确了该蛋白与锌指蛋白和蛋氨酸转运ATP结合蛋白等蛋白存在相互作用,可能与H.pylori的DNA转运有关。4.明确了Hpsh0459是一种定位于细菌细胞膜和膜周质中的有浓度依赖性细胞毒作用的蛋白。能刺激细胞IL-8的分泌,与组织炎症的发生有关;5.成功构建了hpsh0459基因敲除载体pBlueKM40-?hpsh0459::kan。