染色体加倍影响部分野生百合光合作用和灰霉菌感病差异的生理机制

来源 :北京林业大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:hlexcuner
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野生百合是重要的育种材料,但由于引种区与原产地气候差异大,尤其是夏季高温多雨易引起灰霉病的爆发,严重制约着野生百合的开发利用。多倍体育种是提高植物引种驯化效率和抗逆性的重要育种途径。目前野生百合倍性研究大多停留在离体多倍体诱导阶段,倍性效应对生长和灰霉病抗性的影响未有报道。因此,本研究以川滇百合(Lilium primulinum var.ochraceum)、岷江百合(L.regale)和南川百合(L.rosthorii)的无菌鳞片或种子为材料研究多倍体诱导技术体系的建立,并对获得的四倍体进行移栽,从表型、叶片解剖结构、叶绿体超微结构和光合作用等方面分析倍性效应。以长势最旺盛的南川百合及其四倍体为材料,研究染色体加倍对百合灰霉菌感病差异的影响,并从组织、生理和分子水平探究引起差异的机制。另外,首次在百合中观察到草酸是椭圆葡萄孢(Botrytis elliptica)重要的致病因子,从组织、生理和分子水平确定了其致病机理并对不同倍性水平南川百合的防御机制进行了初步的研究,主要结果如下:(1)以试管鳞茎为材料建立了川滇百合的离体多倍体诱导技术体系。川滇百合鳞片预培养15 d可提高诱导存活率;秋水仙素和安磺灵为诱导剂,最适宜的诱导处理为0.100%秋水仙素以及0.010%安磺灵各处理24 h,前者的诱导率为26.67%,显著高于后者(18.89%)。经流式细胞仪(flow cytometry,FCM)和染色体压片法鉴定,共获得74株四倍体川滇百合。另外,以30枚岷江百合无菌鳞片为材料,预培养7 d后经0.050%秋水仙素处理24 h获得5株四倍体。对加倍材料的气孔性状进行观测,结果显示川滇百合和岷江百合的气孔长度与倍性水平的皮尔逊相关性系数分别为0.911和0.980。(2)研究了以种子为材料建立百合多倍体诱导体系。化学诱导剂处理前需进行预培养,当南川百合种子萌发至0.2-0.5 cm可提高诱导存活率;秋水仙素和安磺灵为诱导剂,最适宜的诱导处理为0.050%的秋水仙素处理36 h以及0.010%安磺灵处理24h,前者的诱导率为27.78%,显著高于后者(22.22%)。经FCM和染色体压片法鉴定,共获得199个基因型的四倍体南川百合。对胚轴的变异率与诱导率进行相关性分析,秋水仙素和安磺灵中变异胚轴与倍性水平的相关系数分别为0.989和0.975,该指标可作为种子诱导加倍时早期倍性鉴定的形态指标;气孔长度与倍性水平的相关系数为0.773,表明气孔特性还可能受基因型的影响。(3)以川滇百合、岷江百合、南川百合以及其对应的四倍体为材料进行离体和田间生长比较。在离体条件下,多倍体诱导初期三种百合均出现鳞片分化速度缓慢和不定芽叶片粗糙的现象。多次离体继代后,染色体加倍对川滇百合和南川百合的表型和生长速度无显著影响。四倍体岷江百合与其二倍体相比叶片始终粗糙、鳞片分化不定芽数更多以及鳞茎增重速度更快。染色体加倍对三种百合叶片的表型和解剖结构、叶绿素含量、叶绿体超微结构、叶片可溶性糖和淀粉含量以及气孔淀粉数量等性状的影响因基因型而异。此外,染色体加倍未影响三种百合的光合作用模式,但对光合速率的影响因基因型而异:川滇百合和南川百合的光合速率随着倍性水平的增加出现了不同程度的提高;岷江百合与其四倍体在自然条件下净光合速率无显著差异,但四倍体光响应曲线和CO2响应曲线的最大净光合速率显著低于二倍体。染色体加倍显著提高了三种百合的鳞茎移栽存活率且鳞茎大小均随着倍性水平的增加而增加,鳞茎根系也更为发达。(4)通过田间生长调查和离体接种的方式,确定加倍后的南川百合对灰霉病具有更强的抗性。离体接菌叶片周围常观察到大量无色透明且大小和形态不一的晶体,疑似真菌非特异性致病因子草酸。健康叶片外施草酸溶液后出现了与离体接菌后相同的变化,包括气孔淀粉水解、保卫细胞核解离或位置紊乱以及气孔非正常开放。以上组织观察的结果确定了草酸是椭圆葡萄孢的致病因子,能干扰气孔的正常功能。此外,通过菌丝与叶片表层结构互作、Ca OX沉积位点、感病叶片损伤位点和胼胝质沉积位点确定了气孔密度较气孔大小对病原菌入侵影响更大。(5)以离体接菌0-72 h的二倍体和四倍体南川百合叶片为材料,探究染色体加倍影响灰霉菌感病差异的生理机制。四倍体草酸氧化酶(oxalate oxidase,OXO)活力在接菌12-48 h显著高于二倍体,表明其降解草酸效率更高且草酸降解产物过氧化氢(hydrogen peroxide,H2O2)的积累更多。此外,在活性氧(reactive oxygen species,ROS)产生系统中超氧阴离子(superoxide anions,O2-)和H2O2在四倍体叶片接菌2-24(36)h后积累速度更快,达到峰值所需时间更短,但二倍体和四倍体ROS峰值无显著差异。ROS清除系统中二倍体和四倍体超氧化物歧酶(superoxide dismutase,SOD)活力无显著差异但四倍体过氧化物酶(peroxidase,POD)活力在接菌2-12 h显著高于四倍体。接菌8 h后,二倍体的丙二醛(Malondialdehyde,MDA)积累量显著高于四倍体。对相关通路上的基因表达水平进行分析,四倍体中2个编码OXO的基因(Lr GLP1和Lr GLP2)、3个ROS产生和清除相关的关键基因(Lr RBOHD,Lr GST和Lr POD)和3个位于ROS下游编码病程相关蛋白(pathogenesis-related proteins,PRs)的关键基因(Lr CHI,Lr BGL和Lr PR10)的相对表达水平在接菌24(12)-36(48)较二倍体更高。
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