【摘 要】
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骨骼肌对于运动、姿势支撑、呼吸和产热等重要生物学功能的行使至关重要。骨骼肌是人体的最大器官（按质量计）,占健康个体的质量约40%。骨骼肌纤维含有肌节,它们的一致收缩可以产生机体日常生活运动所需的力量。卫星细胞在一般情况下处于静止状态,机体受到损伤后会被激活成成肌细胞,它对骨骼肌的生长发育以及损伤修复具有重要作用。所以,对骨骼肌卫星细胞的研究具有重要的实际意义。C2C12细胞是小鼠成肌细胞系,可以被
【基金项目】
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国家自然科学基金（31372283）； 种业团队（2018LM2150）；
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骨骼肌对于运动、姿势支撑、呼吸和产热等重要生物学功能的行使至关重要。骨骼肌是人体的最大器官（按质量计）,占健康个体的质量约40%。骨骼肌纤维含有肌节,它们的一致收缩可以产生机体日常生活运动所需的力量。卫星细胞在一般情况下处于静止状态,机体受到损伤后会被激活成成肌细胞,它对骨骼肌的生长发育以及损伤修复具有重要作用。所以,对骨骼肌卫星细胞的研究具有重要的实际意义。C2C12细胞是小鼠成肌细胞系,可以被广泛用于对成肌分化过程的研究。mi RNA是短链的非编码RNA,可通过调控其靶基因的表达发挥重要功能。已经有研究表明mi R-501-3p在癌症等疾病中具有重要的作用,且大量研究表明mi R-501-3p能够调控细胞增殖、分化和迁移。然而,关于mi R-501-3p在C2C12增殖分化迁移期的作用知之甚少。本研究通过过表达和干扰mi R-501-3p,研究其对C2C12细胞增殖、分化、迁移的作用,采用生物信息学方法预测其靶基因,验证靶向关系后构建靶基因过表达载体,在C2C12细胞中过表达和干扰靶基因,研究靶基因功能,并在C2C12细胞中完成功能回复验证。主要研究结果如下:1、mi R-501-3p对C2C12细胞增殖的影响分别过表达和干扰mi R-501-3p后24 h,通过Ed U法和流式细胞术检测C2C12细胞增殖,结果显示mi R-501-3p能够抑制C2C12细胞增殖。q RT-PCR和Western blot结果显示,mi R-501-3p在m RNA水平和蛋白水平能够抑制CCNA的表达、上调CCNB的表达。综上,mi R-501-3p能够通过抑制CCNA的表达促进CCNB的表达（P<0.01）从而抑制C2C12细胞增殖。2、mi R-501-3p对C2C12细胞分化的影响分别过表达和干扰mi R-501-3p后,待C2C12细胞达到90%左右汇合后,诱导其分化,分别于诱导分化3 d、5 d进行Myosin免疫荧光,q RT-PCR和Western blot检测Myo G和Myosin的表达水平。结果显示,mi R-501-3p能够通过促进Myo G、Myosin的相对m RNA水平和蛋白水平（P<0.001）从而促进C2C12细胞分化。3、mi R-501-3p对C2C12细胞迁移的影响分别过表达和干扰mi R-501-3p后24 h,通过划痕实验检测C2C12细胞迁移。结果显示,mi R-501-3p不影响C2C12的迁移。4、mi R-501-3p靶基因预测和验证使用生物信息学方法预测靶基因,通过双荧光素酶报告系统、q RT-PCR和Western blot验证靶向关系。结果显示mi R-501-3p能够直接靶向FOS。5、FOS对C2C12细胞增殖分化及相关基因的影响成功构建了FOS过表达和干扰载体pc DNA3.1-FOS、si-FOS,在C2C12细胞上成功过表达和干扰了FOS,通过Ed U法、流式细胞术、Myosin免疫荧光检测。实验结果显示,FOS促进C2C12细胞的增殖、抑制其分化。q RT-PCR和Western blot结果显示,FOS在m RNA水平和蛋白水平能够促进CCNA的表达、抑制CCNB的表达,抑制Myo G和Myosin的相对m RNA水平和蛋白水平从而促进C2C12细胞的增殖抑制其分化。6、mi R-501-3p通过靶向FOS调控C2C12细胞增殖分化及相关基因表达通过功能回复实验（Ed U法、Myosin免疫荧光检测）,我们发现共转mi R-501-3p和pc DNA3.1抑制C2C12细胞增殖,促进C2C12细胞分化,而这种效果能被共转mi R-501-3p和pc DNA3.1-FOS所逆转;共转NC和pc DNA3.1-FOS促进C2C12细胞增殖,抑制C2C12细胞分化。在蛋白水平也得出一致的结果。7、Myo D-mi R-501-3p-FOS-Mdfi-Myo D形成反馈回路通过双荧光素酶报告系统、Ch IP验证发现FOS抑制Mdfi表达,Myo D增加mi R-501-3p水平,最后由Myo D-mi R-501-3p-FOS-Mdfi-Myo D形成反馈环进而调节C2C12成肌分化。总之,我们的结果显示mi R-501-3p通过抑制其靶基因FOS表达来抑制C2C12增殖并促进C2C12分化。我们的结果还表明除了Myo D和FOS反馈环之外,还存在由Myo D-mi R-501-3p-FOS-Mdfi形成的调节环以调节成肌细胞发育。我们的结果显示了mi RNA和基因参与控制骨骼肌发育,扩展了我们对肌肉肌源性发育机制的理解。
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