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本课题主要是由两个部分组成。一个部分是通过化学诱导激活标签构建拟南芥突变体库,并从中筛选到两个盐信号突变体;另外一个部分是对拟南芥中的AtCRK3蛋白进行了生化、生理方面的研究。
在植物功能基因组研究中,突变体在研究基因功能方面起到十分重要的作用。将PER16载体随机插入到拟南芥基因组中构建成突变体库是一种十分有效的研究基因功能的方法,可以发现到一些在其它组成型增强子调控下而导致生长受到严重影响甚至致死型的突变体。此部分的主要实验结果如下:
在拟南芥转化实验中,采用的是Col-0型拟南芥,农杆菌菌株为GV3101,通过农杆菌侵染方法(floraldip),将基于雌激素受体的化学诱导激活标签系统PER16转入拟南芥中。另外从本突变体库T2代种子中筛选出几个形态方面突变体,其中一株属于雌激素诱导表达型突变体,而此基因的插入失活突变体则没有明显的表型。以上结果表明已成功地构建了诱导型激活拟南芥突变体库。
对来源于本实验室构建的诱导型激活拟南芥突变体库的200,000粒T2代种子进行了盐信号突变体的筛选。盐耐受突变体的筛选方法是挑取能够在含有250mMNaCl固体培养基上萌发的拟南芥突变体,最后得到1株突变体,称之为highsalttolerant1(hstl)。
另外在筛选突变体的过程中,发现一株突变体的形态同野生型不同。另外在高浓度的ABA和LiCl的条件下,hssl在种子萌发阶段也比野生型要敏感,而在正常的生长条件下以及高浓度的Mannitol条件下,hssl的种子萌发率同野生型一致。通过遗传分析发现此突变体的表型为单基因隐性突变导致,同Kan抗性连锁。
钙作为第二信使在不同的细胞生理过程中起到了重要的作用。而钙调素又是通过钙调素结合蛋白起作用。本研究利用分子生物学、细胞遗传学、组织化学、细胞生物学等技术对AtCRK3在拟南芥的生长发育过程中的表达及功能方面进行了深入的探索。本实验通过序列分析表明,AtCRK3包括所有的激酶结构域的保守区,N末端含有一个豆蔻酰基化位点,C末端含有退化了的EF手型。通过BactoBac系统,在昆虫细胞中表达AtCRK3蛋白,通过Ni-NTA柱纯化蛋白,并进行了体外激酶活性分析。