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本课题在前期研究工作基础上，紧密围绕“芽孢杆菌与宿主肠上皮细胞相互作用”这一主题，首先以IPEC-1细胞为体外肠上皮细胞模型，构建枯草芽孢杆菌与肠上皮细胞互作模型，以枯草芽孢杆菌B10为肠道有益菌，以大肠杆菌K88和沙门氏菌作为肠道病原菌，通过IPEC-1细胞与枯草芽孢杆菌B10、大肠杆菌K88或沙门氏菌共培养试验，采用台盼蓝排除检测法和乳酸脱氢酶活性测定，研究枯草芽孢杆菌B10、大肠杆菌K88和沙门氏菌对IPEC-1细胞活性的影响，评估枯草芽孢杆菌B10作为益生菌的安全性。第二，运用荧光定量PCR技术，研究枯草芽孢杆菌B10对IPEC-1细胞TLRs信号传导途径、细胞屏障和免疫功能相关基因表达的影响，开展芽孢杆菌-肠上皮细胞的相互作用及其TLRs信号传导途径的研究。为了更好地探明枯草芽孢杆菌B10对畜禽动物肠黏膜屏障功能调节作用，本课题随后开展枯草芽孢杆菌B10对仔猪生长性能和肠粘膜免疫功能影响的研究，为其在畜禽养殖业中的科学推广应用提供技术支撑和科学依据，同时为益生菌的研发奠定一定的理论基础。主要研究结果如下: (1)枯草芽孢杆菌B10对IPEC-1细胞活性的影响。本实验以IPEC-1细胞为体外猪肠上皮细胞模型，以枯草芽孢杆菌B10为肠道有益菌，以大肠杆菌K88和沙门氏菌作为肠道病原菌，通过IPEC-1细胞与枯草芽孢杆菌B10、大肠杆菌K88或沙门氏菌共培养试验，采用台盼蓝排除检测法和乳酸脱氢酶活性测定，研究枯草芽孢杆菌B10、大肠杆菌K88和沙门氏菌对IPEC-1细胞活性的影响，评估枯草芽孢杆菌B10作为益生菌的安全性。结果表明，枯草芽孢杆菌B10不会影响IPEC-1细胞存活率和细胞膜的完整性，对IPEC-1细胞无毒害作用，枯草芽孢杆菌B10具有安全性，可选为益生菌;而大肠杆菌K88和沙门氏菌显著影响IPEC-1细胞的存活率和细胞膜的完整性，会对IPEC-1细胞造成严重损伤。 (2)以IPEC-1细胞为体外肠上皮细胞模型，构建枯草芽孢杆菌B10与肠上皮细胞互作模型，运用荧光定量PCR技术，研究枯草芽孢杆菌B10对IPEC-1细胞TLRs信号传导途径、机械屏障、免疫屏障功能相关基因表达的影响。荧光定量PCR结果显示，枯草芽孢杆菌B10处理3h显著提高IPEC-1细胞MyD88、NFKB-p50、TLR4基因表达量(P＜0.01)，显著降低IPEC-1细胞TRAF-6、NOD-1、TLR2、TLR6、TLR9基因表达量(P＜0.01);表明枯草芽孢杆菌B10可以调节IPEC-1细胞TLR和NOD先天免疫识别受体家族成员及其信号通路的基因表达，发挥其免疫调节作用。枯草芽孢杆菌B10处理3h显著提高IPEC-1细胞Vill绒毛蛋白的基因表达量(P＜0.01)，而对OCLN闭锁蛋白、CLND3闭合蛋白、CLND4闭合蛋白、MUC-1粘蛋白的基因的表达量无显著影响（P＞0.05）;提示枯草芽孢杆菌B10未对肠上皮细胞之间的紧密连接产生损伤，可以维持肠上皮细胞的完整性，且促进肠上皮细胞Vill绒毛蛋白的基因表达。枯草芽孢杆菌B10处理3h显著提高IPEC-1细胞促炎细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6、趋化因子IL-8和抗炎细胞因子TGF-β、IL-10基因表达量(P＜0.01);表明枯草芽孢杆菌B10可调节IPEC-1细胞细胞因子和趋化因子表达，诱导肠上皮细胞的免疫应答。综上所述，枯草芽孢杆菌B10可调节IPEC-1细胞绒毛蛋白的表达，维护肠上皮细胞的屏障功能，调节IPEC-1细胞细胞因子和趋化因子表达，诱导肠上皮细胞的免疫应答，同时增强IPEC-1细胞的促炎反应和抗炎反应，维持细胞促炎反应和抗炎反应平衡，推测这可能是通过Toll-样受体介导的，依赖接头蛋白MyD88的NF-κB和MAPK信号传导途径形成的，与枯草芽孢杆菌B10调节IPEC-1细胞TLR和NOD先天免疫识别受体家族成员及其信号通路的基因表达，发挥其免疫调节作用有关。 (3)研究枯草芽孢杆菌B10替代抗生素对仔猪生长性能及其肠黏膜屏障功能的影响。选取72头平均体重大约为14.5kg的杜长大三元杂交仔猪，随机分成2个处理组，每个处理组3个重复，每个重复12头仔猪，抗生素对照组饲喂添加40克/吨的基础饲粮，枯草芽孢杆菌B10组饲喂添加1011cfu芽孢杆菌/吨基础饲粮，不添加任何抗生素。试验期30天。仔猪饲养试验主要研究结果分以下两个部分:①枯草芽孢杆菌B10对仔猪生长性能和血清生化指标的影响。枯草芽孢杆菌B10组仔猪实验末重和抗生素对照组无显著差异(P＞0.05)，而枯草芽孢杆菌B10组仔猪日增重比抗生素对照组显著提高了2.29％(P＜0.05)。表明饲喂枯草芽孢杆菌B10替代抗生素对仔猪有一定的促生长作用，提高仔猪的生长性能。饲喂枯草芽孢杆菌B10对仔猪血清的胆固醇、甘油三酸酯、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白和尿素氮无显著影响(P＞0.05)，表明枯草芽孢杆菌B10替代抗生素后未对机体脂类代谢、蛋白质代谢和氨基酸之间的平衡造成影响。枯草芽孢杆菌B10组仔猪血清的血糖(P＜0.05)显著降低、碱性磷酸酶显著提高(P＜0.01)，表明枯草芽孢杆菌B10替代抗生素提高仔猪的生长性能可能与仔猪血糖水平的降低和碱性磷酸酶含量升高有一定的相关性。枯草芽孢杆菌B10组仔猪血清的乳酸脱氢酶、谷草转氨酶、谷丙转氨酶显著降低(P＜0.01)，表明饲喂枯草芽孢杆菌B10替代抗生素对仔猪肝脏、肾脏和心脏等均无损害作用，可有效缓解或预防抗生素引起的肝脏损伤，改善仔猪的机体健康，进一步表明枯草芽孢杆菌B10作为益生菌的安全性。枯草芽孢杆菌B10组仔猪血清的总蛋白、白蛋白、球蛋白显著降低(P＜0.01)，表明仔猪处于一种相对稳定的正常状态，并没有处于应激、感染或者细菌病毒入侵的敏感状态。②枯草芽孢杆菌B10对仔猪肠道免疫功能的影响。通过本章动物饲养实验分析结果表明，枯草芽孢杆菌B10组仔猪空肠粘膜DAO活性与抗生素对照组无显著差异(P＞0.05)，提示枯草芽孢杆菌B10替代抗生素未对仔猪的肠粘膜造成损伤。枯草芽孢杆菌B10组显著提高仔猪空肠粘膜MPO活性(P＜0.01)，表明枯草芽孢杆菌B10替代抗生素能有效增强仔猪的免疫功能，抵抗病原微生物的入侵。荧光定量PCR结果显示，枯草芽孢杆菌B10组仔猪空肠粘膜MyD88、TRAF-6、NFKB-p50、TLR2、TLR4、TLR9基因表达量显著高于抗生素对照组(P＜0.01)，NOD-1、TLR6基因表达量与抗生素对照组无显著差异(P＞0.05)，表明枯草芽孢杆菌B10可调节仔猪肠道粘膜TLR和NOD先天免疫识别受体家族成员及其信号通路的基因表达，发挥其免疫调节作用。与抗生素对照组相比，枯草芽孢杆菌B10组仔猪空肠粘膜紧密连接蛋白OCLN基因表达量显著降低(P＜0.01)、绒毛蛋白Vill基因表达量显著提高(P＜0.01)，而枯草芽孢杆菌B10组仔猪空肠粘膜的紧密连接蛋白CLND3、CLND4和粘蛋白MUC-1基因表达量与抗生素对照组无显著差异(P＞0.05)，表明枯草芽孢杆菌B10替代抗生素可调节仔猪肠道粘膜绒毛蛋白的基因表达，维护肠道屏障功能，改善肠道环境和通透性。与抗生素对照组相比，枯草芽孢杆菌B10组仔猪空肠粘膜促炎细胞因子TNF-α、IL-1α、IL-6、趋化因子IL-8和抗炎细胞因子TGF-β、IL-10基因表达量显著提高(P＜0.01)。进一步的ELISA分析结果表明，与对照组相比，枯草芽孢杆菌B10组仔猪空肠粘膜促炎细胞因子TNF-α和IFN-γ的蛋白含量显著提高(P＜0.01)，而枯草芽孢杆菌B10组仔猪空肠粘膜促炎细胞因子IL-1β、IL-6、趋化因子IL-8、抗炎细胞因子IL-4和IL-10蛋白含量与抗生素对照组无显著差异。表明枯草芽孢杆菌B10可调节仔猪肠黏膜的免疫应答，表达和分泌细胞因子和趋化因子。综上枯草芽孢杆菌B10替代抗生素可调节仔猪肠道粘膜绒毛蛋白的基因表达，维护肠道屏障功能，改善肠道环境和通透性，调节仔猪肠黏膜的免疫应答，表达和分泌细胞因子和趋化因子，促进仔猪健康。推测这可能是通过TLRs介导的信号传导途径形成的，与枯草芽孢杆菌B10可调节仔猪肠道粘膜TLR和NOD先天免疫识别受体家族成员及其信号通路的基因表达，发挥其免疫调节作用有关。 综上所述，枯草芽孢杆菌B10对IPEC-1细胞无毒害作用。枯草芽孢杆菌B10可通过改善仔猪肠道粘膜机械屏障和免疫功能，维持其肠道健康，从而促进其生长。枯草芽孢杆菌B10能调节IPEC-1细胞的屏障功能和断奶仔猪的肠道屏障功能，推测这可能与枯草芽孢杆菌B10调节IPEC-1细胞和仔猪肠道粘膜TLRs信号传导途径有关。上述研究结果，初步揭示了枯草芽孢杆菌B10调节IPEC-1细胞的屏障功能和断奶仔猪的肠道屏障功能的机理，为养猪生产中科学合理使用枯草芽孢杆菌B10替代抗生素提供科学依据和理论基础。