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背景和目的:单磷酸腺苷活化蛋白激酶,(AMP-activated protein kinase,AMPK),是细胞的能量感受器,,能够调控脂质和,蛋白质的代谢、,细胞的生长和凋亡。,作为能量代谢调节因子,在正常和肿瘤细胞的生长中扮演着举足轻重的作用,是近年来肿瘤,生物学领域中至关重要的研究对象。在细胞面临,能量应激时,AMP/ATP,比率升,高,AMPK,被激活,从而促进脂肪酸的氧化,;而在,能量充足或,代谢综合征、肿瘤等病理状态下,,AMPK,活性受到抑制。因此,AMPK,被认为是治疗代谢性疾,病如糖尿病或癌症的潜在靶点。有研究表明,当AMPKα1,的S/T-Loop上485位丝氨酸(Ser485)被IGF-1,磷酸化后,AMPKα1,活性中心172位苏氨酸(Thr172),磷酸化被抑制,AMPK,的活性降低,并且IGF-1,刺激Ser485,磷酸化是通过Akt,途径介导的。然而,我们在,PI3K,和,Akt,呈永久磷酸化的胰腺癌细胞中,并没有检测到Ser485,的磷酸化。目前关于AMPKα1 Ser485磷酸化的研究均是在正常细胞中进行,认为Akt,是Ser485的磷酸化激酶,而本研究将在胰腺癌组织和结肠癌细胞中对AMPKα1 Ser485,磷酸化状态进行特征化研究,旨在探索癌细胞中,AMPKα1 Ser485,磷酸化的上游激酶。研究方法:1.胰腺癌组织中AMPKα1 pThr172,AMPKα1 pSer485以及pAkt等指标的表达情况。我们收集了总共39例(男22例,女17例)胰腺癌蜡块标本,分别对癌组织和癌旁组织用抗AMPKα1 pThr172,AMPKα1 pSer485,ACC pSer79,LKB1,Akt,pThr308,Akt pSer473的抗体进行免疫组化染色,并分析AMPK S485磷酸化和AMPK活性之间的相关性。2.AMPKα1 Ser485磷酸化激酶的初步探索。分别将LKB1,PKB(Akt),PKCδ,PKCλ,PKCε,IKKα,IKKβ的基因通过质粒转染转入HEK293T细胞中,利用蛋白免疫印记法检测细胞内S485磷酸化水平的变化。3.观察HCT116细胞中PI3K对AMPKα1 Ser485磷酸化的影响。分别用LY294002和胰岛素处理细胞,利用蛋白免疫印记法检测细胞内Akt Ser473和AMPKα1 Ser485/Thr172磷酸化水平的变化。4.观察HCT116细胞中Akt抑制剂MK2206对AMPKα1 Ser485磷酸化的影响。用不同浓度Akt抑制剂MK2206处理细胞,利用蛋白免疫印记法检测细胞内Akt Ser473和AMPKα1 Ser485/Thr172磷酸化水平的变化。5.观察HCT116细胞中PKC对AMPKα1 Ser485磷酸化的影响。分别用Akt抑制剂MK2206、PI3K抑制剂LY29400、PKC抑制剂GO6983和mTOR抑制剂Rapamycin处理细胞,利用蛋白免疫印记法检测细胞内Akt Ser473和AMPKα1Ser485/Thr172磷酸化水平的变化。6.观察HCT116细胞中不同激酶抑制剂与insulin共处理对AMPKα1 Ser485磷酸化的影响。先用胰岛素预处理细胞后,再分别用不同的激酶抑制剂(MK2206,GO6983,LY294002,Rapamycin)处理细胞,利用蛋白免疫印记法检测细胞内Akt Ser473和AMPKα1 Ser485/Thr172磷酸化水平的变化。结果:1.胰腺癌组织免疫组织化学染色结果显示,与正常胰腺组织相比,胰腺癌组织中AMPKα1 Ser485磷酸化升高,而AMPKα1 Thr172磷酸化降低,但是Akt Ser473磷酸化水平在正常胰腺组织和胰腺癌组织中没有明显差异。2.在HEK293T细胞中,PKB和PKC均可能是AMPKα1 Ser485的磷酸化激酶。3.PI3K抑制剂LY294002抑制Akt Ser473和AMPKα1 Ser485磷酸化,insulin升高Akt Ser473和AMPKα1 Ser485磷酸化水平,但均不影响AMPKα1 Thr172磷酸化。且LY294002能翻转insulin对Akt Ser473和AMPKα1 Ser485磷酸化水平的升高作用。4.Akt抑制剂MK2206使Akt Ser473磷酸化降低,但不影响AMPKα1 Ser485和AMPKα1 Thr172的磷酸化水平。5.PKC抑制剂GO6983降低AMPKα1 Ser485磷酸化水平,并使AMPKα1Thr172磷酸化升高,同时伴有Akt Ser473磷酸化水平的降低。6.MK2206抑制insulin对AMPKα1 Ser485磷酸化的升高,LY294002和GO6983对insulin介导的AMPK Ser485磷酸化的抑制作用相当,并且,insulin不影响GO6983对AMPKα1 Thr172磷酸化的升高作用。结论:单磷酸腺苷活化蛋白激酶(AMPK)Ser485在结肠癌细胞中的磷酸化是由PKC介导的。