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新城疫(Newcastledisease,ND)是由新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)强毒引起的禽类急性、高度接触性传染病,对家禽危害严重。上世纪80年代以来,我国采取了接种ND疫苗的防控策略,ND灭活苗和弱毒活疫苗在全国范围内得到了大量应用,使ND疫情得到了有效控制。ND灭活苗产生的抗体效价高且维持时间长,而ND活疫苗产生的抗体速度快,且还能刺激黏膜产生有效的黏膜抗体IgA,这类抗体对鸡群也起着重要的保护作用。但目前我国对ND疫苗的免疫效力评价方法,主要是检测免疫后鸡血清中的HI抗体水平,为了综合评价ND活疫苗的免疫效力,本研究建立了检测ND IgA特异性抗体的间接ELISA方法。当前我国NDV的主要流行株属于基因VⅦ型,2014年自基因Ⅶ型ND灭活疫苗研制成功后,其在我国大多数鸡群中得到了广泛应用,且本室针对流行株研制的Ⅶ型ND弱毒活疫苗也快进入临床。但我国现有的ND疫苗免疫程序主要针对基因Ⅱ型疫苗株所制定,基因Ⅱ型ND疫苗与VⅦ疫苗免疫后产生的抗体水平及消长规律并不一致。为了给临床上Ⅶ型ND疫苗的科学使用提供有益参考,本研究对Ⅶ型ND疫苗免疫鸡后产生的HI抗体和特导性IgA抗体进行了检测和分析,在此基础上制定了针对基因Ⅶ型ND疫苗的免疫程序。1检测NDV特异性IgA抗体的间接ELISA方法建立为综合分析ND活疫苗免疫后鸡体内抗体产生水平,本研究以弱毒活疫苗候选株A-NDV-LX/I4为包被抗原,通过对ELISA各环节反应条件的优化,建立了检测NDV特异性IgA抗体间接ELISA方法。试验结果表明,抗原包被浓度为4.8μg/mL,封闭液选用1%BSA,酶标抗体工作浓度为1:20000,显色液反应时间为37℃C 15min时,所建立的间接ELISA检测效果最佳。此外,我们将该弱毒株以106EID50/只的剂量,免疫4周龄SPF鸡,并用建立的ELISA方法和商品化鸡IgA抗体检测试剂盒对免疫后采集的气管冲洗液、十二指肠冲洗液、盲肠冲洗液以及胆汁样品进行IgA抗体检测。结果显示,本研究建立的间接ELISA方法和试剂盒均可很好的检测出上述组织中的IgA抗体,并且IgA抗体水平动态变化趋势基本一致。弱毒苗A-NDV-LX/I4免疫后,免疫鸡胆汁、十二指肠冲洗液和盲肠冲洗液中可检测出较高水平的NDV特异性IgA抗体,与商品化检测试剂盒相比,本研究所建ELISA方法阴性对照样品的OD值更低,显示出了更好的特异性。2带有GFP标记的NDV强毒的构建及基因VⅦ型ND疫苗免疫程序研究以NDV流行强毒株JS5/05/Go为骨架,将绿色荧光蛋白(GFP)基因分别插入NDV基因组的P和M基因之间以及HN和L基因之间,获得重组病毒rNDV/vI4GFP-P/M和rNDV/vI4GFP-HN/L。经过生物学特性及动物致病性的测定,发现重组病毒rNDV/vI4GFP-HN/L的毒力及繁殖性能均与母本病毒JS5/05/Go相似,可作为一个理想的攻毒用模式病毒。基于ND基因VⅦ型弱毒疫苗候选株A-NDV-LX-14和重组NDV灭活疫苗株A-Ⅶ,研究了商品鸡的ND免疫程序。针对商品蛋鸡和商品肉鸡分别制定了 6种和4种不同免疫方式,免疫后按时采血分离血清用于HI抗体检测,并采集气管冲洗液、十二指肠冲洗液、盲肠冲洗液和胆汁样品用于黏膜IgA抗体检测。在32日龄时用重组模式病毒rNDV/vI4GFP-HN/L攻毒,攻毒后第3d、5d和7d采集喉头拭子和泄殖腔拭子用于病毒分离。商品蛋鸡免疫程序研究结果表明:活疫苗最佳首免日龄为7日龄,1日龄免疫时受母源抗体的干扰较大而影响免疫效果;灭活苗首免日龄为7～14日龄时,可以使鸡群在免疫后很长时间内维持较高的HI抗体。另外,21日龄之内免疫两次ND活疫苗的实验组,其NDV特异性IgA抗体水平普遍较仅免疫一次ND活疫苗组高,且持续时间更长。攻毒试验结果显示,除对照组以外的各免疫组攻毒后均未检测到排毒。商品肉鸡免疫程序研究结果显示,所有免疫组鸡在41日龄之前HI抗体均在5log2以上,并且各组之间差异不大,表明基因VII型ND疫苗具有较强的免疫效力。结合NDV特异性IgA抗体水平检测结果,ND活疫苗最佳首免日龄为7日龄,20日龄时加免,可保证免疫鸡群体内NDV特异性IgA抗体长期处于较高水平;ND灭活疫苗的最佳免疫日龄为7日龄,可使免疫鸡群的HI抗体在高滴度水平持续5周以上。此外,仅在20日龄免疫ND活疫苗的实验组在攻毒时IgA抗体水平较低,在攻毒后免疫鸡仍可排毒,从而证实了 ND活疫苗产生黏膜免疫的重要性。