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背景:心血管疾病严重威胁人类身体健康,已位列全球致死疾病之首。动脉粥样硬化(Atherosclerosis,AS)是众多心血管疾病共同的主要病理基础。内皮细胞是血管壁的重要组成部分,在调节血流、血小板激活、白细胞粘附等过程中发挥不可或缺的作用。当血管内皮细胞受损时,血管收缩和舒张平衡被打破,内皮功能受到影响。而内皮细胞功能障碍是多种心血管疾病发生过程中的始动因素或促进因素。因此,早期防治内皮功能障碍是预防和治疗心血管疾病的关键。同型半胱氨酸(Homocysteine,Hcy)是心血管疾病特别是动脉粥样硬化的一个独立、重要的危险因子。Hcy是人体内甲硫氨酸代谢过程中产生的中间产物。空腹血浆中Hcy高于15μM被称为高同型半胱氨酸血症(Hyperhomocysteinemia,HHcy)。研究表明HHcy与血管内皮细胞损伤相关,可能与氧化应激、炎症应答、亚硝基化水平下调等方面有关,但具体机制仍不明确,因此继续寻找治疗Hcy引起心血管疾病,特别是动脉粥样硬化的靶点至关重要。线粒体不仅是细胞合成ATP的主要场所,还参与诸如钙稳态平衡、信号传导、自噬等诸多生物进程。研究发现在心血管疾病患者的内皮中,线粒体动态平衡发生改变。线粒体动态平衡的病理性变化与内皮细胞功能相关。目前鲜少报道Hcy致内皮细胞线粒体损伤及其与内皮功能障碍关联性的研究,因此急需深入探讨Hcy与内皮细胞线粒体损伤及相关机制,以期为心血管疾病的治疗提供研究靶点。Ca2+信号通过影响线粒体相关生物进程在细胞存活中扮演不可或缺的角色。Ca2+稳态失衡会引起细胞功能障碍以及代谢紊乱。线粒体-内质网偶联结构(Mitochondria-associated endoplasmic reticulum membranes,MAM)是线粒体外膜与内质网膜形成的紧密接触部位,是调节细胞中内质网与线粒体间Ca2+穿梭的核心场所。近年研究发现MAM结构在脂质合成、Ca2+信号传导、线粒体生物合成与动态变化、自噬、细胞存活等生物进程中发挥核心作用。MAM结构具有多种连接桥梁蛋白,如 PACS-2,Mfn2-Mfn1/2,IP3R-Grp75-VDAC 等。研究发现 PACS-2(phosphofurin acidic cluster sorting protein 2)在线粒体-内质网通讯、内质网稳态和细胞凋亡中发挥重要作用,参与维持MAM结构的完整性。Mfn2-Mfn1/2起线粒体-内质网物理连接作用,但是其正向或负向维持MAM结构仍处于争议之中。Grp75连接内质网膜蛋白IP3R和线粒体外膜蛋白VDAC,是内质网向线粒体释放Ca2+的重要通道。此外,在多种疾病中,如神经退行性疾病、代谢性疾病、肿瘤等,均发现MAM结构发生改变。迄今尚未见Hcy对内皮细胞MAM结构及线粒体Ca2+影响的研究,故MAM结构和Ca2+信号成为本课题的的研究重点,以期寻找Hcy致内皮损伤特别是线粒体损伤的靶点。因此,本文以血管内皮细胞为研究对象,旨在考察Hcy对线粒体功能的影响,并探索相关机制,着重探讨MAM结构及其中Ca2+信号在Hcy致内皮细胞线粒体损伤中的作用,为深入揭示Hcy致内皮受损的机制提供实验依据,以期为Hcy相关心血管疾病的治疗提供新思路。目的:探索Hcy对内皮细胞线粒体功能的影响及相关机制。方法:1.采用外源性Hcy处理人脐静脉内皮细胞EA.hy926细胞株。MTT法检测不同浓度Hcy处理内皮细胞24 h后的细胞活力,以及同一浓度Hcy处理内皮细胞不同时间的细胞活力,初期确定Hcy的作用浓度和时间。2.Westcm-blot考察Hcy处理内皮细胞后内皮损伤标志蛋白表达水平。总NO检测试剂盒检测细胞内总NO水平。3.透射电镜考察Hcy对内皮细胞亚细胞结构的影响。JC-1染色检测Hcy对内皮细胞线粒体膜电位的影响。ATP检测试剂盒考察Hcy对内皮细胞ATP含量的影响。DCFH-DA探针检测Hcy对内皮细胞ROS生成的影响。4.蛋白质免疫共沉淀考察Hcy对内皮细胞MAM结构中Grp75与IP3R、VDAC的相互作用影响,Western-blot检测Hcy对MAM连接蛋白PACS-2的表达影响。5.Western-blot检测Hcy对内皮细胞线粒体动态变化相关蛋白,凋亡相关蛋白以及自噬相关蛋白表达水平的影响。免疫荧光分别检测Hcy对内皮细胞线粒体分裂蛋白Drp1和线粒体自噬标志蛋白Parkin的线粒体转位影响。6.Rhod 2 AM探针标记线粒体Ca2+,流式细胞仪检测Hcy对内皮细胞线粒体Ca2+浓度的影响。7.IP3R抑制剂Xestospongin C(XeC)与Hcy共处理,考察IP3R介导的Ca2+信号在Hcy致内皮细胞线粒体动态平衡改变及线粒体自噬中的作用。结果:1.Hcy对EA.hy926内皮细胞造成浓度依赖性损伤:D,L-Hcy对EA.hy926内皮细胞活力的IC50为6.03 mM。不同浓度Hcy作用于内皮细胞24 h,细胞活力呈浓度依赖性减弱。Hcy以800μM浓度作用于内皮细胞3,6,12,24 h,细胞活力呈时间依赖性减弱。后期以200,400,800μM Hcy处理内皮细胞24 h展开研究。Western-blot结果显示与对照组相比,Hcy(800 μM)处理内皮细胞24h后,内皮细胞标志物CD31和VEGF表达显著减少,eNOS活性位点Ser1177磷酸化水平呈浓度依赖性下调,抑制性位点Thr495磷酸化水平上调,内皮收缩因子ET-1表达显著增加,且细胞内总NO水平下降。2.Hcy引起内皮细胞线粒体功能障碍及线粒体自噬激活,未激活内质网应激:透射电镜结果显示线粒体结构损伤程度随Hcy浓度依赖性加重。JC-1染色结果显示内皮细胞线粒体膜电位随Hcy浓度依赖性下降,ATP含量减少,ROS水平升高。对照组和Hcy处理组中,凋亡相关蛋白Bax/Bcl-2比值以及细胞色素C无明显变化,表明Hcy未激活内皮细胞线粒体依赖的凋亡信号通路。进一步研究发现Hcy处理组内皮细胞中自噬体显著增加。Western-blot及免疫荧光结果显示Hcy引起内皮细胞自噬标志蛋白LC3 II型表达增加,线粒体自噬标志蛋白Parkin在线粒体膜上聚集。此外,透射电镜结果中观察到内质网形态无明显改变,且Western-blot结果显示Grp78和p-eIF2α(Ser51)表达量与对照组相比无明显变化,提示Hcy未引起内皮细胞内质网应激,Hcy对内皮细胞线粒体的损伤先于内质网。3.Hcy引起内皮细胞MAM结构增强以及线粒体Ca2+浓度增加:通过透射电镜观察到Hcy处理组内皮细胞中内质网与线粒体紧密接触部位的数量以及长度与对照组相比均显著增加,提示Hcy引起内皮细胞MAM结构增加。Western-blot结果显示Hcy处理内皮细胞后,MAM连接蛋白PACS-2的表达水平显著上调,Mfn2表达显著下调,Mfnl无明显变化。蛋白质免疫共沉淀结果显示MAM结构中Grp75与IP3R、VDAC的相互作用增强。Western-blot结果显示Hcy引起内皮细胞MCU表达水平增加,mNCX表达无明显变化。采用Rhod2AM探针标记线粒体Ca2+,流式细胞术以及荧光成像研究结果均显示.Hcy引起内皮细胞线粒体Ca2+浓度升高。进一步使用IP3R抑制剂Xestospongin C(XeC)抑制IP3R介导的Ca2+流,发现Hcy + XeC共处理组中,线粒体Ca2+浓度较Hcy处理组降低,表明Hcy引起线粒体Ca2+浓度升高,这可能与其致MAM结构中IP3R-Grp75-VDAC复合体形成增加有关。4.Hcy通过激活GSK3[3和改变线粒体Ca2+信号影响线粒体动态平衡:通过Western-blot考察线粒体分裂和融合相关蛋白,发现Hcy引起线粒体分裂-融合动态平衡紊乱,使线粒体融合减少,分裂增加,表现为线粒体融合蛋白Mfn2表达水平显著降低,Mfnl表达未受影响,线粒体分裂蛋白Drp1表达水平显著增加。进一步研究发现Hcy引起内皮细胞线粒体组分中p-mTOR(Ser2481)、p-Akt(Ser473)和p-GSK3β(Ser9)水平显著下调,GSK3β与Drp1相互作用增强,提示Hcy引起线粒体过度分裂与抑制mTORC2/Akt/GSK3β信号通路,激活GSK3β有关。此外,使用IP3R抑制剂XestosponginC(XeC)抑制IP3R介导的Ca2+流后发现Hcy+ XeC共处理组中,Drp1表达以及线粒体转位均显著减少,提示Hcy引起线粒体过度分裂还与线粒体Ca2+浓度增加有关。5.Hcy引起内皮细胞线粒体Ca2+升高参与线粒体功能障碍及线粒体自噬的发生:与Hcy处理组相比,Hcy+ XeC共处理组中,内皮细胞ATP水平和线粒体膜电位均有所增加,自噬标志蛋白LC3Ⅱ型表达下调,Parkin与线粒体外膜蛋白Tom20的共定位减弱,提示Hcy引起内皮细胞线粒体Ca2+升高参与线粒体自噬的发生。结论:1.Hcy致内皮细胞毒性过程中,对线粒体的损伤先于内质网。Hcy呈浓度依赖性引起线粒体功能障碍,表现为线粒体膜电位下降,ATP水平降低,ROS水平升高,但未激活线粒体依赖的细胞凋亡分子事件。2.Hcy上调MCU表达水平,不影响mNCX水平,导致线粒体Ca2+浓度升高,继而引起线粒体分裂增加,线粒体功能障碍,以及线粒体自噬的激活。Hcy导致的线粒体Ca2+浓度升高可能与其增强Grp75和IP3R、VDAC的相互作用,上调PACS-2的表达,引起内皮细胞MAM结构增强有关。此外,Hcy引起线粒体分裂过度还与抑制mTORC2/Akt/GSK3β信号通路,激活GSK3β有关。