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【目的】采用GatewayTM技术构建人骨形态发生蛋白-2基因重组腺病毒载体,力图缩短重组腺病毒BMP-2的构建周期,提高构建成功效率,为进一步对骨缺损、骨创伤等疾病采用骨基因治疗以提高成骨速率及成骨质量奠定实验基础。【方法】依据Genbank中hBMP-2序列化学合成含BamHI及EcoRI酶切位点的两条引物,应用PCR方法扩增BMP-2目的基因,并插入克隆载体pMD19-T simple vector中,接着转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,提取重组质粒获得了TS-BMP-2,酶切鉴定并进行测序分析。基因测序正确后,重组质粒TS-BMP-2与穿梭载体pEC3.1(+)分别各用BamHI和EcoRI两步法双酶切后连接,从而将TS-BMP2基因亚克隆到穿梭载体pEC3.1(+)中,连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞进行扩菌,质粒小量纯化试剂盒抽提,获得pEC3.1-BMP-2穿梭质粒。pEC3.1-BMP-2用HindIII和EcoR I双酶切后,应用LR ClonaseII重组酶,与pAd/BLOCK-iTTM-DEST腺病毒载体进行体外同源重组反应,连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞进行扩菌,抽提质粒,获得pAd-BMP-2重组质粒,同时用XbaI酶切鉴定及PCR鉴定重组质粒的正确性。重组质粒pAd-BMP-2经PacI酶切线性化后转染HEK 293细胞进行包装,获得重组腺病毒rAd-BMP-2颗粒,经PCR方法鉴定所得rAd-BMP-2为正确目的腺病毒载体。将所得病毒原液反复转染HEK 293细胞后进行病毒扩增,经3-4代大量病毒扩增后收集并纯化,获得了实验所需要的病毒滴度,最后用空斑实验方法测定病毒滴度。Ad-GFP转染MSCs测定腺病毒载体转染效率,确定最佳感染复数。Ad-BMP-2体外转染MSCs,Western blot检测BMP-2在蛋白水平的表达。【结果】成功构建Ad-BMP-2腺病毒载体,测得病毒滴度为1×1010 pfu/ml。Ad-GFP转染MSCs,当MOI为100时,超过95%的细胞出现荧光,选择MOI=100为最佳感染复数。病毒感染四周后镜下仍可见细胞出现荧光,表明获得的重组腺病毒活性较高,可以有效转导目的基因并维持一定时间表达。Ad-BMP-2转染MSCs后,初始有部分细胞呈皱缩表现,甚至死亡,24h后开始恢复原有形态。Western blot检测转染细胞48h即有BMP-2基因表达,在2周和3周时表达较强,4周后表达开始减弱,5周后表达明显减弱。实验表明构建的腺病毒载体可有效转染MSCs,目的基因可在一定时间内高水平表达。【结论】成功地构建人骨形态发生蛋白2基因重组腺病毒载体,明显缩短了重组腺病毒BMP-2的构建周期,提高构建成功率。在腺病毒载体介导下BMP-2基因可高效感染人骨髓间充质干细胞,基因转染效率及表达水平均较高。目的基因在体外实验中可持续表达4周以上,为后续实验应用于BMP-2基因治疗和在骨组织工程中对种子细胞进行基因改造,使局部组织BMP-2浓度达到预期的水平奠定了实验基础。