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防风为伞形科植物防风Saposhnikovia divaricata（Turcz.）Schischk未抽花茎植株的干燥根。防风作为我国传统中药,广泛分布于我国东北、内蒙古等地,在传统中医药理论中属于解表类药物,主要用于头痛感冒、风湿痹痛、风疹瘤痒、破伤风等病症。防风广泛用于痹证治疗,尤其是痹证范畴下的类风湿性关节炎（Rheumatoid arthritis,RA）,但其具体的药效物质基础及作用机制尚不明确。现代中药化学和药理学研究表明,防风主要含有色原酮、香豆素、挥发油、多糖等活性成分,具有解热、镇痛、抗炎、抗肿瘤、免疫调节以及神经保护等药理活性。课题组前期研究结果表明防风中的人参炔醇和5-O-甲基维斯阿米醇苷等化学成分通过抗炎作用表现出较好的抗肝损伤以及神经保护作用。本论文在前期研究基础上,对防风中有效物质进行制备及结构表征分析,结合药理学研究进一步阐明防风的防治RA及伴发抑郁症的药效物质基础及作用机制。具体实验设计及结果如下:1、防风活性成分的制备及结构表征首先运用硅胶柱层析法以及制备液相技术,对防风的乙醇提取物进行分离,得到7种小分子化合物。经过高效液相色谱鉴定,核磁共振波谱、气相色谱质谱联用技术结构解析,证实上述化合物分别属于防风中色原酮类:升麻素（化合物A,纯度为98.70%）,亥茅酚苷（化合物B,纯度为98.22%）,5-O-甲基维斯阿米醇苷（化合物C,纯度为99.75%）,升麻素苷（化合物D,纯度为98.04%）;香豆素类:欧前胡素（化合物E,99.93%）,花椒毒素（化合物F,98.81%）;挥发油类:人参炔醇（化合物G,纯度为98.31%）。采用热浸法、分级醇沉法得到从醇浓度30%～85%共6个级分的防风粗多糖。经过除杂,DEAE-52纤维素和Sephadex G-100葡聚糖凝胶色谱分离纯化,得到各级分的纯化多糖。检测各级分多糖的总糖含量、蛋白质、糖醛酸以及分子量。同时对各级分的纯化多糖进行生物活性检测,发现多糖SD-60在抑制成纤维滑膜细胞（RA-FLS）活力方面要显著强于其他多糖组分。因此重点对多糖SD-60进行了结构解析。单糖组成分析结果表明,SD-60主要由甘露糖（Man）、葡萄糖醛酸（Glu A）、半乳糖醛酸（Gal A）、葡萄糖（Glu）、半乳糖（Gal）以及阿拉伯糖（Ara）组成,其摩尔比（%）为Man:Glu A:Gal A:Glu:Gal:Ara=4.16:1.97:37.46:2.12:16.42:37.87。综合利用红外光谱、核磁共振波谱、甲基化结合GC-MS、扫描电镜和刚果红实验等分析手段对SD-60的结构特征进一步解析。结果表明SD-60是一种具有三股螺旋结构的酸性多糖,其主链为→{[4)-α-D-Gal Ap-（1→5）-α-L-Araf-（1→4）-α-D-Gal Ap-（1→5）-α-L-Araf-（1→6）-β-D-Galp-（1]8→3,6）-α-D-Manp-（1→3）-β-D-Manp-（1→4,6）-β-D-Glcp-(1}23→;在单糖残基→3,6)-α-D-Manp-（1→和→4,6）-β-D-Glcp-（1→的C6和C4处分别连接→5）-α-L-Araf-(1→支链;端链T-β-D-Galp-(1→和T-β-D-Glc Ap-(1→连结在支链的C5处。2、防风对胶原蛋白诱导大鼠类风湿性关节炎（CIA）药效物质基础研究建立CIA大鼠模型,分离培养CIA大鼠的成纤维滑膜细胞（RA-FLS）,筛选对RA-FLS有显著影响的药效物质,并阐明其作用机制。然后研究有效物质对CIA大鼠的药效和作用机制。（1）防风成分对RA-FLS的活性影响及作用机制从防风7种小分子化合物和6种纯化多糖中,通过CCK-8法筛选出对RA-FLS细胞活力具显著影响的人参炔醇（PAL）和多糖SD-60。流式细胞术以及Ed U增殖实验结果显示PAL（40,50,60μM）和SD-60（30,40,50μg/m L）显著诱导RA-FLS凋亡并且抑制增殖。Wastern blot实验结果显示PAL和SD-60显著促进Bax和Cleaved-caspase 3、抑制Bcl-2的蛋白表达。细胞划痕和Transwell实验结果表明PAL（1,2,5μM）和SD-60（1,2.5,5μg/m L）显著抑制RA-FLS的迁移和侵袭,并显著抑制MMP-2/9、促进TIMP-1/2的蛋白表达。ELISA和Wastern blot实验结果显示PAL（1,2,5μM）和SD-60（1,2.5,5μg/m L）可以抑制炎症因子分泌,并抑制TLR4/TRAF6、NF-κB/IκB-α信号通路的激活。（2）PAL和SD-60对CIA大鼠的药理活性及作用机制研究CIA大鼠模型建立成功后,PAL（40,80 mg/kg）和SD-60（40,80 mg/kg）分别连续灌胃给药21天。实验结果显示PAL和SD-60均能显著降低CIA大鼠关节炎指数以及免疫器官指数,对炎症因子也有明显的抑制作用。H＆E和番红O-固绿染色显示PAL和SD-60显著缓解大鼠膝、踝关节的炎性浸润,对软骨也有保护作用。Wastern blot实验结果显示PAL和SD-60显著抑制CIA大鼠滑膜中TLR4/TRAF6、NF-κB/IκB-α信号通路的激活。综上,得出PAL和SD-60是防风治疗RA的主要药效物质基础的结论。PAL和SD-60对CIA大鼠的RA具有显著疗效,其主要通过抑制Bcl-2、MMP-2/9,促进Bax、Cleaved-caspase 3、TIMP-1/2蛋白表达,进而诱导RA-FLS凋亡,抑制其增殖、迁移和侵袭。同时通过抑制TLR4/TRAF6、NF-κB/IκB-α信号通路的激活有效缓解CIA大鼠膝、踝关节的炎性浸润以及滑膜炎症的发生。3、防风对抑郁症的药效物质基础研究作为RA的并发症,抑郁症与其有着非常紧密的联系。因此进一步研究防风各成分对抑郁症的影响。主要通过炎症爆发和下丘脑-垂体-肾上腺轴（HPA轴）过度活化两方面诱导的抑郁症进行探讨。通过建立LPS和CUMS诱导抑郁症模型对防风各成分的抗抑郁药理活性和作用机制进行研究。（1）对LPS诱导小鼠抑郁模型的影响首先通过悬尾试验（TST）和强迫游泳试验（FST）考察防风7种小分子和6种纯化多糖在小鼠行为绝望模型中的抗抑郁效应。实验结果表明PAL（0.1,1 mg/kg,腹腔注射）给药7天后能够显著减少小鼠的不动时间。后续主要考察PAL的抗抑郁作用及机制。在LPS诱导小鼠抑郁模型行为学检测结果中,PAL显著减少了TST和FST的不动时间,增加了小鼠在旷场试验（OFT）和高架十字迷宫试验（EPM）中的运动时间和探索频率,显著改善了小鼠的抑郁样行为;并且抑制了炎症因子分泌和氧化应激发生;抑制了小鼠海马体中NF-κB/IκB-α、促进了BDNF/Trk B的蛋白表达。（2）对LPS诱导BV-2小胶质细胞炎症模型的影响BV-2小胶质细胞主要存在于海马体中,其过度活化是炎症引发抑郁症的关键因素。实验结果显示PAL（1,5,10μM）能够抑制BV-2小胶质细胞活力,同时抑制细胞中炎症因子分泌和氧化应激发生,并抑制细胞中NF-κB/IκB-α、促进BDNF/Trk B的蛋白表达。（3）对CUMS诱导小鼠抑郁模型的影响HPA轴的过度激活是慢性不可预见性温和应激（CUMS）诱导小鼠产生抑郁症的主要因素。行为学实验结果显示PAL（0.1,1 mg/kg,腹腔注射）给药治疗21天后能有效改善小鼠的抑郁状态。抑制HPA轴中促肾上腺皮质激素释放激素（CRH）、促肾上腺皮质激素（ACTH）和皮质酮（CORT）的分泌;促进海马体中5-HT/5-HIAA、DA/HVA的表达,增加神经营养因子（BDNF）代谢,促进谷氨酸受体1（Glu R1）、突触后致密蛋白95（PSD95）、突触素1（Synapsin I）以及下丘脑谷胱甘肽还原酶（GR）的蛋白表达,改善神经突触功能。综上,得出PAL是防风治疗抑郁症的主要药效物质基础的结论。相较于防风其它成分,PAL的抗抑郁作用够更加显著,其原因可能是PAL的分子量较小且具有较适合的脂水分配系数,更容易进入中枢神经系统（CNS）。PAL通过抑制炎症爆发和HPA轴过度激活而表现出较好的抗抑郁作用,为后续RA及伴发抑郁症的作用及机制研究打下了良好的基础。4、PAL对CIA大鼠伴发抑郁症的作用及机制研究首先建立CIA大鼠模型,然后通过TST筛选出具有明显抑郁症状的大鼠作为RA伴发郁郁症模型动物,PAL（0.07,0.7mg/kg,腹腔注射）给药治疗7天后进行相关指标测定。TST试验结果表明,PAL显著减少大鼠的不动时间。大鼠血清中的炎症因子以及海马体中的氧化应激反应受到显著抑制,HPA轴的过度活化受到抑制,神经营养因子代谢能力得到增强。Wastern blot实验结果显示PAL抑制了NF-κB/IκB-α信号通路的激活,促进了BDNF/Trk B、Glu R1、PSD95和Synapsin I的蛋白表达,有效改善大鼠海马体中神经突触的传递功能。综合以上所有实验结果表明,防风治疗RA的主要药效物质基础为PAL和SD-60,治疗RA伴发抑郁症的主要药效物质基础为PAL。PAL属于挥发油类,符合防风作为辛温解表类中药的药性理论。防风传统用药多为水煎剂,而多糖SD-60易溶于水,这也与防风的传统用药理念相符。通过以上研究以期为中药防风的质量控制、加工炮制和开发利用提供新的思路,也为RA及伴发抑郁症的治疗药物研发奠定基础。