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我们以往的研究表明吴茱萸碱(evodiamine)可有选择性地杀伤肿瘤细胞，其对人黑色素瘤A375-S2及人宫颈癌HeLa细胞的细胞毒性较强，而对人正常的外周血单核细胞基本没有影响。由于黑色素瘤的死亡风险极高，且宫颈癌的发病率在中国女性中居首位，吴茱萸碱的这种良好的抗癌活性使得吴茱萸碱具有很好的应用前景。为深入了解吴茱萸碱的抗癌机制，我们在本篇论文中详细地阐述了调节吴茱募碱诱导A375-S2及HeLa细胞死亡的具体机制，并着重考察并比较了活性氧(ROS)及一氧化氮(NO)在这两株细胞中的作用。另外，我们对有名的预防癌症类药物genistein在吴茱萸碱诱导的HeLa细胞周期阻滞中发挥的作用也做了详细的报道。
由于大量文献表明ROS可诱导多种癌细胞系的凋亡，因而我们对ROS在吴茱萸碱处理的细胞中发挥的作用进行了研究。流式细胞分析显示吴茱萸碱处理A375-S2细胞后可引起细胞内快速的产生大量的ROS，随后即出现线粒体膜电位(△ψm)的去极化。ROS清除剂的加入挽救了吴茱萸碱引起的△ψm溃散及细胞凋亡的发生，而线粒体膜通透性转换(MPT)抑制剂的加入抑制了ROS的产生及凋亡的发生，提示这其中存在ROS诱导的ROS释放(RIRR)机制。我们在进一步检测死亡受体Fas途径及线粒体途径相关主要蛋白的表达情况后发现，ROS和MPT可通过调控Fas相关死亡域(FADD)、caspase-8、Bax、Bcl-2、细胞色素c及去乙酰化酶SIRT1来激活以上这两种途径，这两种途径并可汇集于由caspase-3介导的同一条途径来执行凋亡。该结果表明RIRR可通过对细胞外及细胞内两种凋亡途径的调节来促进细胞凋亡的发生。由于通常NO可与ROS-道来决定细胞的命运，我们也研究了NO在吴茱萸碱诱导的A375-S2细胞凋亡中发挥的作用。结果显示吴茱萸碱对NO的产生有着强烈的诱导作用，诱导型NO合酶(iNOS)可呈正反馈调节机制来诱导NO的产生。产生的NO能介导吴茱萸碱引起的A375-S2细胞的凋亡及周期阻滞，上调肿瘤抑制因子p53和细胞周期相关蛋白p21，并下调控制细胞生长与死亡平衡的AKt蛋白激酶B(PKB)来中止细胞生长信号。通过阻断p38 MAPK和核内因子-κB(NF-κB)后，我们发现iNOS的表达、NO的产生及细胞损伤都可被显著地抑制，提示p38 MAPK和NF-κB对NO合成系统的关键作用。另外，我们还看到ROS可通过调节iNOS、p53、p21、Akt/PKB、p38 MAPK及NF-κB控制这些过程，表明在吴茱萸碱处理的A375-S2细胞中NO可受到ROS的调节。在HeLa细胞中，吴茱萸碱同样也促进了细胞内产生大量的ROS和NO。它们可共同通过诱导△ψm的丧失、促/抑凋亡蛋白Bax/Bcl-2(或Bcl-XL)比例的上调以及细胞色素c的释放来促进线粒体依赖的凋亡的发生。而由于自噬通常可伴随凋亡的发生，并可拮抗或促进凋亡的发生，我们观察了自噬的情况。研究发现吴茱萸碱可促进自噬的发生，并上调自噬调控蛋白Beclin 1的表达以及与自噬体膜形成有关的LC3-II/LC3-I的比例。自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)的加入可增加吴茱萸碱引起的细胞死亡，提示自噬在细胞中的保护作用。更重要的是，我们发现ROS和NO在调节凋亡的同时，又可对自噬的调节起到重要的作用。适量的ROS/NO的产生可导致自噬的激活，而过量的ROS/NO的产生则对自噬过程起到抑制作用。
另外，我们发现genistein可抑制吴茱萸碱诱导的HeLa细胞周期阻滞的发生。当加入胰岛素样生长因子-1受体(IGF-1R)、Ras、Raf或c-Jun氨基末端激酶(JNK)的抑制剂可减轻吴茱萸碱的细胞毒作用，而genistein、Ras或Raf的抑制剂又可降低JNK的磷酸化水平，表明Ras-Raf-JNK途径参与了其中。进一步的研究表明，genistein或JNK的抑制剂可阻止ROS和NO的产生，而ROS或NOS的抑制剂又能拮抗JNK的磷酸化。这种存在于JNK和ROS/NO合成之间的正反馈调节机制进而激活了p53和p21，磷酸化了细胞分裂周期25C(Cdc25C)]Cdc2，并降低了cyclin B1的表达。以上结果表明genistein可通过抑制依赖JNK的蛋白酪氨酸激酶(PTK)途径及ROS/NO的合成这两种方式来促进吴茱萸碱处理的HeLa细胞周期的正常进行。
综上所述，我们的研究表明ROS和NO是调节吴茱萸碱诱导A375-S2及HeLa细胞凋亡的两个重要的因素。在吴茱萸碱诱导的HeLa细胞中，它们同时也参与了对起到保护细胞作用的自噬过程的调控。而吴茱萸碱诱导的HeLa细胞凋亡中ROS/NO合成及PTK信号途径的参与则使得genistein对细胞的保护作用成为可能。这些发现为我们认识细胞内氧化还原状态对吴茱萸碱的细胞毒作用的复杂的调控提供了重摹的支持。