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[目的]探讨替莫唑胺联合丙戊酸钠对小鼠垂体腺瘤细胞AtT-20、GT1-1增殖的抑制作用以及凋亡的促进作用,并探讨其可能的分子机制。[方法]1.细胞培养:小鼠垂体腺瘤细胞AtT-20、GT1-1培养于含10%胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)的 DMEM/High Glucose 培养基中,放置于 37℃、5%CO2的细胞培养箱中培养,视细胞生长状态,间隔约1-2天半量换液一次,3天左右1:3传代一次。取对数生长期的细胞进行实验。2.TMZ与VPA对AtT-20、GT1-1细胞增殖的影响。取对数生长期的AtT-20、GT1-1细胞,将细胞分为(1)AtT-20细胞TMZ组:向细胞中分别加入不同浓度(0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2mM)TMZ,并分别培养 24、48、72h;(2)AtT-20细胞VPA组:向细胞中分别加入不同浓度(2、4、8、16、32、64mM)VPA,并分别培养24、48、72h;(3)GT1-1细胞TMZ组:向细胞中分别加入不同浓度TMZ(浓度同前),并分别培养24、48、72h;(4)GT1-1细胞VPA组:向细胞中分别加入不同浓度VPA(浓度同前),并分别培养24、48、72h,通过CCK-8法检测TMZ与VPA各自对AtT-20、GT1-1细胞增殖的影响。3.TMZ与VPA联合应用对小鼠垂体腺瘤细胞AtT-20、GT1-1细胞活性的影响。取对数生长期的AtT-20、GT1-1细胞,将细胞分为(1)对照组(加入等量完全培养基);(2)TMZ 组(加入 1.6mMTMZ);(3)VPA 组(加入 16mMVPA);(4)TMZ+VPA组(加入1.6mM TMZ以及加入16mM VPA)。药物处理72h后,通过LDH法检测TMZ与VPA联合应用对AtT-20、GT1-1细胞活性的影响。4.TMZ与VPA联合应用对小鼠垂体腺瘤细胞AtT-20、GT1-1细胞凋亡的影响。取对数生长期的AtT-20、GT1-1细胞,按照上述分组,分别给予完全培养基、TMZ以及VPA,药物处理72h后,通过TUNEL染色、流式细胞计数检测TMZ与VPA联合应用对AtT-20、GT1-1细胞凋亡的影响;通过Hoechst 33258染色检测TMZ与VPA联合应用对AtT-20、GT1-1细胞形态学的影响。5.TMZ与VPA联合应用对小鼠垂体腺瘤细胞AtT-20、GT1-1细胞凋亡影响的分子机制。取对数生长期的AtT-20、GT1-1细胞,按照上述分组,分别给予完全培养基、TMZ以及VPA,药物处理72h后,通过Western blot检测TMZ与VPA 联合应用对 AtT-20、GT1-1 细胞 cleaved Caspase-3、cleaved Caspase-9、Bax、Bcl-2、AIF、cleaved PARP、p53等凋亡相关蛋白表达水平的影响。[结果]1.TMZ与VPA对AtT-20、GT1-1细胞增殖的影响。CCK-8法检测结果显示:TMZ、VPA分别作用于AtT-20、GT1-1细胞后,细胞增殖与对照组相比明显抑制且具有统计学意义(p<0.05),TMZ、VPA对细胞增殖具有显著的抑制作用,且呈现明显的剂量依赖性与时间依赖性。2.TMZ与VPA联合应用对小鼠垂体腺瘤细胞AtT-20、GT1-1细胞活性的影响。LDH法检测结果显示:TMZ、VPA分别作用于AtT-20、GT1-1细胞后,细胞活性与对照组相比明显降低且具有统计学意义(p<0.05),TMZ与VPA联合应用后细胞活性进一步降低,结果具有统计学意义(p<0.05)。3.TMZ与VPA联合应用对小鼠垂体腺瘤细胞AtT-20、GT1-1细胞凋亡的影响。TUNEL染色、流式细胞计数结果显示:TMZ、VPA分别作用于AtT-20、GT1-1细胞后,细胞凋亡水平与对照组相比显著升高,结果具有统计学意义(p<0.05)TMZ与VPA联合应用后细胞凋亡水平进一步升高,结果具有统计学意义(p<0.05)。Hoechst 33258染色结果显示:TMZ、VPA分别作用于AtT-20、GT1-1细胞后,表现为均匀弥散染色的细胞核(活细胞核)数量减少,浓染致密的颗粒块状荧光(凋亡细胞核)数量增多,细胞凋亡水平与对照组相比显著升高,TMZ与VPA联合应用后凋亡水平进一步升高。4.TMZ与VPA联合应用对小鼠垂体腺瘤细胞AtT-20、GT1-1细胞凋亡影响的分子机制。Western blot检测结果显示:TMZ、VPA分别作用于AtT-20、GT1-1细胞后,细胞中所表达的Bax、AIF以及p53等凋亡相关蛋白表达水平升高,caspase-3、caspase-9、PARP等凋亡相关蛋白活化水平升高,而抗凋亡相关蛋白Bcl-2表达水平降低,结果具有统计学意义(p<0.05);TMZ与VPA联合应用时能够显著升高Bax、AIF以及p53等凋亡相关蛋白的表达水平与caspase-3、caspase-9、PARP等凋亡相关蛋白的活化水平,并进一步降低抗凋亡相关蛋白Bcl-2的表达水平,结果具有统计学意义(p<0.05)。[结论]1.TMZ与VPA作用于小鼠垂体腺瘤细胞AtT-20、GT1-1后,能够显著抑制细胞的增殖,且具有明显的时间依赖性与剂量依赖性;2.TMZ与VPA作用于小鼠垂体腺瘤细胞AtT-20、GT1-1后,能够显著抑制其细胞活性并促进细胞凋亡;3.TMZ与VPA联合应用时,二者表现出协同作用,能够进一步促进垂体腺瘤细胞凋亡、抑制垂体腺瘤细胞活性;4.TMZ与VPA作用于小鼠垂体腺瘤细胞AtT-20、GT1-1后,能够促进细胞中Bax、AIF、以及p53等凋亡相关蛋白表达,促进caspase-3、caspase-9、PARP等凋亡相关蛋白的活化,并降低抗凋亡相关蛋白Bcl-2的表达水平,实现TMZ与VPA对AtT-20、GT1-1细胞凋亡的促进作用。TMZ与VPA联合应用时,能够发挥协同作用,提高这一作用效果,从而进一步促进垂体腺瘤细胞凋亡的发生,说明TMZ与VPA联合应用发挥对肿瘤细胞的凋亡促进作用是通过对细胞凋亡的调控来实现的。