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自交不亲和性(Self-incompatibility,SI)是广泛存在于被子植物中的一种种内生殖障碍。在许多植物中,自交不亲和性通常由单一的复等位基因S-位点(S-locus)控制。在茄科、车前科和蔷薇科植物中,前期的研究发现花柱和花粉自交不亲和性决定因子分别编码S-核酸酶和一个F-box家族的蛋白,SLF/SFB。但是,目前我们对于这类核酸酶类型的自交不亲和性的信号应答的分子和细胞生物学的机制仍然不是很清楚。在本论文的研究中,首先通过反向遗传学的方法研究了一个参与到自交不亲和性信号应答的因子-SSK1的功能。体外生物化学的研究提示 SSK1蛋白特异性的在花粉S因子SLF所构成的SCFsLF复合体中发挥功能。为了进一步研究SSK1在自交不亲和性信号应答中的作用,我们构建了 PhSSK1-RNAi载体并进行了转化基因型为S3LS3L的自交不亲和性的野生型杂交矮牵牛(Petunia hybrida)的实验。经鉴定,共得到了7个独立的T0代转基因株系。进而以野生型SvSv为父本与T0代杂交后得到了T1代植株。分子生物学分析表明,PhSSK1-RNAi转基因片段显著下调了转基因植株花粉中的PhSSK1的表达。对转基因植株的花粉的测交分析结果显示,当PhSSK1表达下调的花粉授原本亲和的正常自交不亲和性的野生型矮牵牛时,花粉表现出明显的异交亲和性的下降。在其T2代中,转基因拷贝出现明显的偏分离情况。而当这些花粉授花柱自交不亲和性丧失的矮牵牛SoSo时,则依然表现为正常的异交亲和授粉。在其T2代中,转基因拷贝也未出现偏分离的情况。这些结果表明 SSK1是花粉异交亲和性所需要的,同时也支持了花粉S基因产物功能的“简单抑制剂模型”,即在茄科类自交不亲和性中,花粉 S因子的作用是直接抑制异己 S-核酸酶的细胞毒性。第二,为了研究基于 S-核酸酶自交不亲和性的细胞生物学机制,我们分别构建了由花粉特异启动子 LAT52和花柱特异启动子 CHI启动的 C端带有 GFP标签的 PhSSK1和S3L-RNase的转化载体,并分别转化了自交不亲和性的S3LSV和S3LS3L的野生型矮牵牛。经鉴定,分别得到了8株PhSSK1-GFP转基因植株和13株S3L-RNase-GFP转基因植株。对PhSSK1的初步的亚细胞定位观察认为,PhSSK1主要定位于花粉管的细胞质中,而且可能与花粉管中的运输小泡共定位,推测花粉S因子和SSK1可能在运输小泡中发挥功能。同时,我们利用体外花粉萌发实验模拟观察了亲和与不亲和授粉后花粉管中S-核酸酶的积累,结果发现作为“自己”的S-核酸酶可以直接在花粉管中积累,而作为“异己”的S-核酸酶则不能积累。当外源加入26S蛋白酶抑制剂MG132的情况下,异己 S-核酸酶则可以在花粉管中产生明显的积累。这一结果提示26S蛋白质降解途径可能直接参与了亲和花粉管对异己S-核酸酶细胞毒性的抑制过程中。综上所述,本论文的结果一方面为SSK1在亲和性信号应答中发挥作用提供了直接证据,另一方面从细胞生物学的角度证实了26S蛋白质降解途径参与了异交亲和反应,为进一步研究自交不亲和性信号应答的分子和细胞机制提供了新的线索。