【摘 要】
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物定基因DNA链断裂已被证明与保肿瘤的发生发展,遗传性病症,以及衰老密切相关,它具有重要的遗传毒理学意义.但目前尚无有效的检测手段.该研究以限制性内切酶Afal为断裂剂,对
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物定基因DNA链断裂已被证明与保肿瘤的发生发展,遗传性病症,以及衰老密切相关,它具有重要的遗传毒理学意义.但目前尚无有效的检测手段.该研究以限制性内切酶Afal为断裂剂,对循环数的探针制备方法进行优化,确立了最佳实验条件.在此条件下,分别用有PI延伸和无P1延伸的连接介导PCR(LMPCR)结合地高辛标记探针杂交检测了Afal和MspI引起的p53基因外显子7的断裂.并用平阳霉素染毒进行了验证.对循环数和探针制备方法比较的结果显示,当采用29个循环扩增,用PCR法制备的探针杂交显示扩增产物,出现了信号强、特异性高的条带.说明在适当范围内增加循环数能提高方法的敏感性和特异性;当被标记DNA链<200bp时,最好采用PCR法制备探针.Afal和MspI酶切片段经LMPCR扩增,杂交后在相应位置均出现清晰扩增带.省去P1延伸后,只能检测Afal引起的平端链断裂.说明非放射性LMPCR能特异地检测p53基因的酶切断裂,且该方法能区分平端和粘端链断裂.通过该研究,建立了一种能检测特定基因DNA链断裂的技术,该技术首次应用琼脂糖凝胶电泳与非放射性杂交结合检测LMPCR结果,使该技术具有更简单,快速,安全的优点.
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