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脱氢抗坏血酸还原酶(DHAR,EC1.8.5.1)以谷胱甘肽为底物,催化脱氢抗坏血酸还原为抗坏血酸,在循环利用抗坏血酸、保护细胞组分抵御氧化损伤中发挥重要的作用。本文利用RT-PCR从江南卷柏中克隆到两个DHAR基因,命名为SmDHAR1和SmDHAR2。对该基因在江南卷柏中的表达模式,编码蛋白的结构与功能进行了研究,其主要结果如下:
1、SmDHAR1 cDNA序列包括657bp的开放阅读框,编码218个氨基酸的蛋白,预测分子量为23.97 kDa。SmDHAR2 cDNA序列包含726bp的开放阅读框,编码的蛋白包含241个氨基酸,预测分子量为27.33 kDa。SmDHAR1基因组序列长1123bp,包括5个内含子,而SmDHAR2基因组序列长1220bp,包括6个内含子。蛋白质三维结构模拟发现,SmDHAR1和SmDHAR2都具有典型的谷胱甘肽转移酶结构,但SmDHAR2比SmDHAR1在C末端多1个α螺旋。
2、通过RT-PCR分析显示在正常生长的江南卷柏中,SmDHAR1与SmDHAR2在叶、菱叶、茎和根组织中均表达,表明该基因是组成型表达基因,可能在江南卷柏的生长发育中发挥着重要作用。
3、在大肠杆菌中表达并纯化了SmDHAR1与SmDHAR2重组蛋白。酶活性分析显示SmDHAR1和SmDHAR2蛋白对底物NBD-C1和CDNB没有活性,但对底物DHA具有催化活性,分别是19.76μmol/min/mg和0.17μmol/min/mg,证明江南卷柏DHAR蛋白具有脱氢抗坏血酸还原酶活性,且SmDHAR1和SmDHAR2对DHA的活性有巨大的分化。SmDHAR1和SmDHAR2的最适pH值分别为7.5和8.0。热力学稳定性检测结果显示SmDHAR1在50℃时还保持着最高活性的80％,而SmDHAR2在50℃时只剩50％的活性,说明了SmDHAR1和SmDHAR2蛋白的热力学稳定性具有较大差异。因此,基于基因结构与酶学性质的差异预示着这两个基因可能存在功能上的分化。