EV71病毒衣壳蛋白VP1基因的克隆、表达及重组蛋白的纯化和鉴定

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手足口病近年来在我国患者比例大幅度提升,截至2011年11月30日,全国累计报告手足口病病例1496048例,EV71型感染比例超过50%;其中重症病例17775例,死亡467人,绝大多数为EV71感染所致。从近年的疫情情况来看,EV71感染呈现爆发时间早,流行时间长,患者大幅度上升,重症患者比例增多的趋势,因此,EV71防治的形势非常严峻。对于肠道病毒EV71,至今未有有效的治疗药物,而且其感染后发病儿童主要是0-5岁,往往病情恶化迅速,来不及治疗便发展成为重症。目前国内外市场上未出现公认的十分有疗效的预防疫苗,因此,开发安全、高效的EN71疫苗已经非常迫切。   目前,EV71蛋白质疫苗研究主要集中在VP1蛋白,VP1是EV71病毒主要的中和抗原决定簇,其编码基因具有与病毒血清型完全对应的遗传多样性,因此VP1是EV71疫苗研究的重要靶位。本研究利用基因重组的技术,首先提取病毒RNA并逆转录成cDNA,以cDNA为模板,PCR扩增得到目的基因VP1,进一步通过双酶切的方法把VP1克隆在PET-his表达载体上,在E.coli/DH5α中扩增,在E.coli/BL21中进行表达。加入IPTG诱导VP1蛋白表达,进一步用蔗糖梯度离心和镍柱纯化的方法纯化VP1蛋白。发现咪唑在110mM时可以得到纯度为98%的目的蛋白,并通过western blot方法证实了纯化的蛋白的正确性,进一步用ELISA的方法验证纯化的VP1的抗原性,结果表明重组蛋白可被人血清中EV71抗体特异性识别,说明我们表达纯化的VP1是一个很有效的抗原,为进一步的疫苗开发奠定了基础。
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