【摘 要】
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Ⅲ目的：构建人防御素HNP-3成熟肽cDNA片段酵母双杂交系统，为研究与防御素HNP-3成熟肽相互作用的肺组织相关蛋白打下基础。Ⅲ方法：培养HL-60细胞，RT-PCR扩增含防御素HNP-3成熟肽的
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Ⅲ目的：构建人防御素HNP-3成熟肽cDNA片段酵母双杂交系统，为研究与防御素HNP-3成熟肽相互作用的肺组织相关蛋白打下基础。Ⅲ方法：培养HL-60细胞，RT-PCR扩增含防御素HNP-3成熟肽的cDNA片段，克隆入pBluescript-SK-Ⅱ质粒，经测序鉴定后，再亚克隆到酵母双杂交诱饵载体pGBKT7中，测序鉴定。用醋酸锂法将重组诱饵质粒转化酵母菌AH109，用缺陷培养基筛选方法进行重组诱饵蛋白自激活和毒性检测。磁珠法提取人肺组织mRNA，用SMART技术经LD-PCR扩增获得全长ds cDNA，转入酵母菌Y187构建肺组织cDNA文库，同时进行杂交筛选。将pGBKT7-HNP-3，肺组织ds cDNA以及文库质粒pGADT7/Rec<->顺序转化酵母菌AH109，β-半乳糖苷酶活性实验以及氨基酸营养缺陷培养双重筛选阳性克隆。结果：构建的重组质粒pbluescript-SK-Ⅱ-HNP-3，经酶切、测序鉴定，插入片段为HNP-3成熟肽的cDNA序列。亚克隆构建重组诱饵质pGBKT7-HNP-3，测序鉴定表明其插入目的基因序列无误。重组诱饵质粒自激活和毒性检测显示无自激活现象发生，对酵母细胞AH109无毒性作用。所构建的肺组织cDNA文库，库容量为1.7×10<6>转化子/3ug pGADT7/Rec<->符合文库构建标准。酵母双杂交后经过双重筛选获得的后选阳性克隆190余个。
结论：成功构建了防御素HNP-3成熟肽的酵母双杂交诱饵载体和人肺组织cDNA文库；酵母双杂筛选获得的侯选阳性克隆为研究防御素HNP-3成熟肽与肺组织相互作用蛋白质打下基础。
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